Begin de test door de gelabelde A.thaliana stuifmeelontvangende plant op zijn kant te leggen en de uitgemergelde bloem op het podium van een omgekeerde microscoop te plaatsen om het stigma in beeld te brengen. Om de positie van de uitgemergelde ontvangerbloem te fixeren, immobiliseert u de stengel met stroken afplaktape. Verwijder van de stuifmeeldonorplant een gezonde en vers geopende bloem en plaats de stuifmeeldonorplant onder een ontleedmicroscoop.
Verzamel stuifmeelkorrels met een tang met een fijne punt. Verwijder overtollige stuifmeelkorrels door de tang lichtjes tegen de donorblaadjes aan te raken totdat de monolaag van de stuifmeelkorrel is gevormd. Keer terug naar de stuifmeelontvangende plant en gebruik een objectief met een laag vermogen om de omgekeerde microscoop op het stigma te richten.
Houd de tang langs de opening tussen de armen van de tang, benader voorzichtig en ongepollineerde stigmatische papillacel. Blijf de ongepolijste stigmatische papillacel benaderen totdat de goed gepositioneerde stuifmeelkorrel op de tang licht contact maakt met het oppervlak. Zodra de stuifmeelaanhechting is bevestigd, trekt u de tang langzaam terug.
Oriënteer de stuifmeelkorrel met zijn equatoriale as zichtbaar en scherp en schakel onmiddellijk over naar een objectief met een hoger vermogen, zoals 20x. Leg het eerste stuifmeelkorrelbeeld vast als T-0 en ga door met het vastleggen van beelden met intervallen van één minuut gedurende 10 minuten. Pas de focus aan om kleine bewegingen in de stuifmeelkorrel of het stigma op te vangen.
Registreer de omgevingstemperatuur en relatieve vochtigheid van de kamer elke twee minuten, zodat toekomstige vergelijkingen tussen experimentele replica's mogelijk zijn. Sla de afbeeldingen op in een verliesvrije indeling, zoals ND2, voordat u de bestuivings- en beeldvormingsstappen voor extra stuifmeelkorrels herhaalt om gegevens te verkrijgen voor controle en experimentele bestuivingen. Begin met de gegevensmetingen voor pollenhydratatietest met behulp van beeldanalysesoftware.
Gebruik vergelijkbare parameters van digitale zoom en de aanpak die de pollengrens definieert voor alle metingen in de datasets. Noteer de semiminor-aswaarden voor alle tijdpunten in de gegevensset. Zodra de metingen voor een gegevensset zijn voltooid, exporteert u de onbewerkte semiminor-aswaarden van elk afzonderlijk tijdspunt naar een spreadsheet.
Presenteer de gegevens in kolommen per afbeeldingsstapel en bereken het percentage semiminor-aswijziging. Herhaal de stappen en verkrijg gegevens van ten minste 15 gehydrateerde stuifmeelkorrels voor elke plantenlijn. Een paar stuifmeelkorrels kunnen niet hydrateren of kunnen aanzienlijk langzamer hydrateren dan verwacht.
Ze staan bekend als dud grains. Sluit deze uit van de gegevensset. Bereken de gemiddelde waarden voor elk tijdspunt per plant met behulp van het gespecialiseerde softwarepakket GraphPad Prism.
Analyseer de hydratatiegegevens van wild-type en mutantlijnen op elk tijdstip met behulp van ongepaarde T-test en eenrichtings-ANOVA om de middelen van het specifieke tijdspunt van belang te vergelijken. Om de middelen over alle tijdpunten te vergelijken, voert u meerdere T-tests uit tussen wild-type en mutantlijnen over meerdere tijdpunten. De pollenhydratatietijdreeksgegevens voor wildplanten die op verschillende dagen werden verzameld, toonden aan dat de minimum- en maximumwaarden voor de middelen tussen replicaties voor alle tijdspunten binnen 3% lagen Deze representatieve gegevens voor bestuivingen van het wildtype toonden een hoge mate van consistentie voor relatief lage monsteraantallen en over verschillende dagen.
