Commencez le test en posant la plante réceptrice de pollen A.thaliana marquée sur le côté, en positionnant la fleur émasculée sur la scène d’un microscope inversé pour imager le stigmate. Pour fixer la position de la fleur réceptrice émasculée, immobiliser la tige à l’aide de bandes de ruban de masquage. De la plante donneuse de pollen, retirez une fleur saine et fraîchement ouverte et placez la plante donneuse de pollen sous un microscope à dissection.
Rassemblez les grains de pollen à l’aide de pinces à pointe fine. Enlevez les grains de pollen en excès en touchant légèrement la pince contre les pétales du donneur jusqu’à ce que la monocouche du grain de pollen soit formée. Retournez à la plante réceptrice du pollen et utilisez une lentille d’objectif de faible puissance pour focaliser le microscope inversé sur le stigmate.
En tenant la pince le long de l’ouverture entre les bras de la pince, approchez prudemment et non pollinisée la cellule de papille stigmatique. Continuez à vous approcher de la cellule papillaire stigmatique non pollinisée jusqu’à ce que le grain de pollen convenablement positionné sur la pince entre en contact léger avec sa surface. Une fois la fixation du pollen confirmée, retirez lentement la pince.
Orientez le grain de pollen avec son axe équatorial visible et mis au point, et passez immédiatement à une lentille d’objectif plus puissante, comme 20x. Capturez la première image de grain de pollen au format T-0 et continuez à capturer des images toutes les minutes pendant 10 minutes. Ajustez la mise au point pour tenir compte des petits mouvements du grain de pollen ou du stigmate.
Enregistrez la température ambiante et l’humidité relative de la pièce toutes les deux minutes, ce qui permet des comparaisons futures entre les répétitions expérimentales. Enregistrez les images dans un format sans perte, tel que ND2, avant de répéter les étapes de pollinisation et d’imagerie pour des grains de pollen supplémentaires afin d’acquérir des données pour le contrôle et les pollinisations expérimentales. Commencez les mesures de données pour le test d’hydratation du pollen à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images.
Utilisez des paramètres similaires de zoom numérique et l’approche définissant la limite pollinique pour toutes les mesures dans les ensembles de données. Enregistrez les valeurs de l’axe demi-mineur pour tous les points temporels du jeu de données. Une fois les mesures terminées pour un jeu de données, exportez les valeurs brutes des demi-petits axes de chaque point temporel individuel vers une feuille de calcul.
Présentez les données en colonnes par pile d’images et calculez le pourcentage de changement d’axe semi-mineur. Répétez les étapes et obtenez des données à partir d’au moins 15 grains de pollen hydratés pour chaque lignée de plantes. Quelques grains de pollen peuvent ne pas hydrater ou peuvent hydrater beaucoup plus lentement que prévu.
Ils sont connus sous le nom de grains ratés. Excluez-les du jeu de données. Calculez les valeurs moyennes pour chaque point temporel par usine à l’aide du progiciel spécialisé GraphPad Prism.
Analysez les données d’hydratation des lignées de type sauvage et mutant à chaque point temporel en utilisant le test T non apparié et l’ANOVA unidirectionnelle pour comparer les moyennes du point temporel spécifique d’intérêt. Pour comparer les moyennes sur tous les points temporels, effectuez plusieurs tests T entre les lignes de type sauvage et les lignes mutantes sur plusieurs points temporels. Les données des séries chronologiques sur l’hydratation du pollen pour les plantes de type sauvage recueillies à différents jours ont montré que les valeurs minimales et maximales pour les moyennes entre les répétitions pour tous les points temporels étaient inférieures à 3 %.
