Beginnen Sie den Test, indem Sie die markierte A. thaliana Pollenempfängerpflanze auf die Seite legen und die entmannte Blüte auf der Bühne eines inversen Mikroskops positionieren, um die Narbe abzubilden. Um die Position der entmannten Empfängerblume zu fixieren, immobilisieren Sie den Stiel mit Klebebandstreifen. Entfernen Sie von der Pollenspenderpflanze eine gesunde und frisch geöffnete Blüte und legen Sie die Pollenspenderpflanze unter ein Präpariermikroskop.
Sammeln Sie Pollenkörner mit einer Pinzette mit feiner Spitze. Entfernen Sie überschüssige Pollenkörner, indem Sie die Pinzette leicht gegen die Spenderblüten berühren, bis sich die Monoschicht des Pollenkorns gebildet hat. Kehren Sie zur Pollenempfängerpflanze zurück und verwenden Sie ein Objektiv mit geringer Leistung, um das inverse Mikroskop auf die Narbe zu fokussieren.
Halten Sie die Pinzette entlang der Öffnung zwischen den Armen der Pinzette und nähern Sie sich vorsichtig der unbestäubten und unbestäubten Narbenpapillenzelle. Nähern Sie sich der unbestäubten Narbenpapillenzelle, bis das entsprechend positionierte Pollenkorn auf der Pinzette leichten Kontakt mit ihrer Oberfläche hat. Sobald die Pollenanhaftung bestätigt ist, ziehen Sie die Pinzette langsam zurück.
Richten Sie das Pollenkorn mit sichtbarer und scharfer Äquatorachse aus und wechseln Sie sofort zu einem Objektiv mit höherer Leistung, z. B. 20x. Nehmen Sie das erste Pollenkornbild als T-0 auf, und setzen Sie die Aufnahme der Bilder 10 Minuten lang in Intervallen von einer Minute fort. Passen Sie den Fokus an, um kleine Bewegungen im Pollenkorn oder in der Narbe zu berücksichtigen.
Zeichnen Sie alle zwei Minuten die Umgebungstemperatur und die relative Luftfeuchtigkeit des Raums auf, um zukünftige Vergleiche zwischen experimentellen Wiederholungen zu ermöglichen. Speichern Sie die Bilder in einem verlustfreien Format, z. B. ND2, bevor Sie die Bestäubungs- und Bildgebungsschritte für zusätzliche Pollenkörner wiederholen, um Daten für die Kontrolle und experimentelle Bestäubung zu erfassen. Beginnen Sie mit den Datenmessungen für den Pollenhydratationstest mit einer Bildanalysesoftware.
Verwenden Sie ähnliche Parameter des Digitalzooms und des Ansatzes zur Definition der Pollengrenze für alle Messungen in den Datensätzen. Notieren Sie die Werte der kleinen Halbachse für alle Zeitpunkte im Dataset. Sobald die Messungen für einen Datensatz abgeschlossen sind, exportieren Sie die Rohwerte der kleinen Halbachse jedes einzelnen Zeitpunkts in eine Tabelle.
Präsentieren Sie die Daten in Spalten pro Bildstapel und berechnen Sie die prozentuale Änderung der kleinen Halbachse. Wiederholen Sie die Schritte und erhalten Sie Daten von mindestens 15 hydratisierten Pollenkörnern für jede Pflanzenlinie. Einige Pollenkörner können möglicherweise nicht oder deutlich langsamer als erwartet hydratisieren.
Sie sind als Blindgänger bekannt. Schließen Sie diese aus dem Datensatz aus. Berechnen Sie die Mittelwerte für jeden Zeitpunkt pro Anlage mit dem speziellen Softwarepaket GraphPad Prism.
Analysieren Sie die Hydratationsdaten von Wildtyp- und Mutantenlinien zu jedem Zeitpunkt mithilfe des ungepaarten T-Tests und der einfaktoriellen ANOVA, um die Mittelwerte des spezifischen Zeitpunkts zu vergleichen. Um die Mittelwerte über alle Zeitpunkte hinweg zu vergleichen, führen Sie mehrere T-Tests zwischen Wildtyp- und Mutantenlinien über mehrere Zeitpunkte durch. Die an verschiedenen Tagen erhobenen Pollenhydratations-Zeitreihendaten für Wildtyp-Pflanzen zeigten, dass die Minimal- und Maximalwerte für die Mittelwerte zwischen den Wiederholungen für alle Zeitpunkte innerhalb von 3 % lagen.
