Inizia il test posando la pianta ricevente di polline di A.thaliana etichettata su un lato, posizionando il fiore evirato sul palco di un microscopio invertito per visualizzare lo stigma. Per fissare la posizione del fiore ricevente evirato, immobilizzare lo stelo usando strisce di nastro adesivo. Dalla pianta donatrice di polline, rimuovere un fiore sano e appena aperto e posizionare la pianta donatrice di polline sotto un microscopio da dissezione.
Raccogli i granelli di polline usando una pinza a punta fine. Rimuovere i grani di polline in eccesso toccando leggermente la pinza contro i petali del donatore fino a formare il monostrato del granello di polline. Tornare alla pianta ricevente del polline e utilizzare una lente obiettivo a bassa potenza per focalizzare il microscopio invertito sullo stigma.
Tenendo il forcipe lungo l'apertura tra le braccia del forcipe, avvicinarsi con attenzione e la cellula della papilla stigmatica non impollinata. Continuare ad avvicinarsi alla cellula della papilla stigmatica non impollinata fino a quando il granello di polline opportunamente posizionato sulla pinza non entra in contatto leggero con la sua superficie. Una volta confermato l'attaccamento del polline, ritirare lentamente la pinza.
Orienta il granello di polline con il suo asse equatoriale visibile e a fuoco nitido, e passa immediatamente a un obiettivo di potenza superiore, come 20x. Acquisire la prima immagine del granello di polline come T-0 e continuare a catturare le immagini a intervalli di un minuto per 10 minuti. Regola la messa a fuoco per accogliere piccoli movimenti nel granello di polline o nello stigma.
Registra la temperatura ambiente e l'umidità relativa della stanza ogni due minuti, consentendo confronti futuri tra repliche sperimentali. Salvare le immagini in un formato senza perdita di dati, ad esempio ND2, prima di ripetere i passaggi di impollinazione e imaging per ulteriori grani di polline per acquisire dati per il controllo e le impollinazioni sperimentali. Iniziare le misurazioni dei dati per il test di idratazione del polline utilizzando il software di analisi delle immagini.
Utilizzare parametri simili di zoom digitale e l'approccio che definisce il limite del polline per tutte le misurazioni nei set di dati. Registrare i valori degli assi semisecondari per tutti i punti temporali nel set di dati. Una volta completate le misurazioni per un set di dati, esportare i valori non elaborati degli assi semiminori di ogni singolo punto temporale in un foglio di calcolo.
Presentare i dati in colonne per pila di immagini e calcolare la variazione percentuale dell'asse semiminore. Ripeti i passaggi e ottieni dati da almeno 15 grani di polline idratati per ogni linea di piante. Alcuni granelli di polline potrebbero non riuscire a idratarsi o potrebbero idratarsi significativamente più lentamente del previsto.
Sono conosciuti come dud grains. Escluderli dal set di dati. Calcola i valori medi per ogni punto temporale per impianto utilizzando il pacchetto software specializzato GraphPad Prism.
Analizza i dati di idratazione da linee wild-type e mutanti in ogni punto temporale utilizzando il T-test spaiato e ANOVA unidirezionale per confrontare le medie dello specifico punto temporale di interesse. Per confrontare le medie su tutti i punti temporali, esegui più test T tra linee wild-type e mutanti su più punti temporali. I dati delle serie temporali di idratazione del polline per le piante selvatiche raccolte in giorni diversi hanno mostrato che i valori minimi e massimi per le medie tra le repliche per tutti i punti temporali erano entro il 3%Questi dati rappresentativi per le impollinazioni selvatiche hanno dimostrato un alto grado di coerenza per numeri di campioni relativamente bassi e in giorni diversi.
