ラベルの付いたA.thaliana花粉レシピエント植物を横に置き、去勢された花を倒立顕微鏡のステージに配置して柱頭を画像化することからアッセイを開始します。去勢されたレシピエントの花の位置を固定するには、マスキングテープのストリップを使用して茎を固定します。花粉供与植物から、健康で開いたばかりの花を取り除き、花粉ドナー植物を解剖顕微鏡の下に置きます。
先端の細かい鉗子を使用して花粉粒を集めます。花粉粒の単層が形成されるまで、ドナーの花びらに鉗子を軽く触れて、余分な花粉粒を取り除きます。花粉受容植物に戻り、低倍率対物レンズを使用して倒立顕微鏡を柱頭に焦点を合わせます。
鉗子の腕の間の開口部に沿って鉗子を保持し、慎重に接近し、受粉していない柱頭乳頭細胞。鉗子上の適切に配置された花粉粒がその表面に軽く接触するまで、受粉していない柱頭乳頭細胞に近づき続けます。花粉の付着が確認されたら、鉗子をゆっくりと引き抜きます。
赤道軸が見えて焦点が合っている花粉粒の向きを変え、すぐに20倍などの高出力の対物レンズに切り替えます。最初の花粉粒画像をT-0として撮影し、1分間隔で10分間撮影を続けます。花粉粒や柱頭の小さな動きに対応するようにフォーカスを調整します。
部屋の周囲温度と相対湿度を2分ごとに記録し、実験反復間の将来の比較を可能にします。追加の花粉粒の受粉とイメージングの手順を繰り返して、対照および実験的な受粉のデータを取得する前に、ND2などのロスレス形式で画像を保存します。画像解析ソフトウェアを用いた花粉水和アッセイのデータ測定を開始します。
デジタルズームの同様のパラメータと、データセット内のすべての測定値の花粉境界を定義するアプローチを使用します。データセット内のすべての時間ポイントの短軸の値を記録します。データセットの測定が完了したら、個々の時点の生の半短軸の値をスプレッドシートにエクスポートします。
画像スタックごとに列にデータを表示し、半短軸の変化率を計算します。手順を繰り返し、各植物系統の少なくとも15個の水和花粉粒からデータを取得します。いくつかの花粉粒は、水和に失敗するか、予想よりも大幅に遅く水和する可能性があります。
それらは不発穀物として知られています。これらをデータセットから除外します。専用のソフトウェアパッケージGraphPad Prismを使用して、プラントごとの各時点の平均値を計算します。
対応のないT検定と一元配置分散分析を使用して、各時点での野生型系統と変異株からの水分補給データを分析して、特定の対象時点の平均を比較します。すべての時点の平均を比較するには、複数の時点にわたって野生型系統と変異株の間で複数のT検定を実行します。異なる日に収集された野生型植物の花粉水和時系列データは、すべての時点の反復間の平均の最小値と最大値が3%以内であることを示しましたこの野生型受粉の代表的なデータは、比較的少ないサンプル数と異なる日にわたって高い一貫性を示しました。
