라벨이 붙은 A.thaliana 꽃가루 수용 식물을 옆으로 눕히고 거세된 꽃을 거꾸로 현미경 무대에 올려 낙인을 이미지화하여 분석을 시작합니다. 거세된 수혜자 꽃의 위치를 고정하려면 마스킹 테이프 스트립을 사용하여 줄기를 고정시킵니다. 꽃가루 기증자 식물에서 건강하고 갓 개봉한 꽃을 제거하고 꽃가루 기증자 식물을 해부 현미경으로 관찰합니다.
끝이 가는 집게를 사용하여 꽃가루 알갱이를 수집합니다. 꽃가루 알갱이의 단층이 형성될 때까지 기증자 꽃잎에 집게를 가볍게 대고 과도한 꽃가루 알갱이를 제거합니다. 꽃가루 수용 공장으로 돌아가 저전력 대물 렌즈를 사용하여 도립 현미경을 낙인에 초점을 맞춥니다.
집게의 팔 사이의 개구부를 따라 집게를 잡고 조심스럽게 접근하고 수분이 부족한 낙인 유두 세포에 접근합니다. 집게에 적절하게 배치된 꽃가루 알갱이가 표면에 가볍게 닿을 때까지 수분되지 않은 낙인 유두 세포에 계속 접근합니다. 꽃가루 부착이 확인되면 집게를 천천히 빼냅니다.
꽃가루 알갱이의 적도 축이 보이고 초점이 선명하게 맞춰지도록 한 다음 즉시 20x와 같은 고출력 대물 렌즈로 전환합니다. 첫 번째 꽃가루 그레인 이미지를 T-0으로 캡처하고 10분 동안 1분 간격으로 이미지를 계속 캡처합니다. 꽃가루 알갱이 또는 암술머리의 작은 움직임을 수용하도록 초점을 조정하십시오.
2분마다 실내 온도와 상대 습도를 기록하여 향후 실험 반복실험 간의 비교를 가능하게 합니다. 추가 꽃가루 알갱이에 대한 수분 및 이미징 단계를 반복하기 전에 ND2와 같은 무손실 형식으로 이미지를 저장하여 제어 및 실험 수분에 대한 데이터를 수집합니다. 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 꽃가루 수화 분석을 위한 데이터 측정을 시작합니다.
디지털 줌의 유사한 매개 변수와 데이터 세트의 모든 측정에 대한 꽃가루 경계를 정의하는 접근 방식을 사용합니다. 데이터 세트의 모든 시점에 대한 반부 축 값을 기록합니다. 데이터 세트에 대한 측정이 완료되면 각 개별 시점의 원시 반부 축 값을 스프레드시트로 내보냅니다.
이미지 스택당 열에 데이터를 표시하고 반부 축 변화의 백분율을 계산합니다. 단계를 반복하고 각 식물 라인에 대해 최소 15개의 수화된 꽃가루 알갱이에서 데이터를 얻습니다. 일부 꽃가루 알갱이는 수분을 공급하지 못하거나 예상보다 훨씬 느리게 수분을 공급할 수 있습니다.
그들은 더드 그레인으로 알려져 있습니다. 데이터 세트에서 제외합니다. 특수 소프트웨어 패키지 GraphPad Prism을 사용하여 플랜트당 각 시점의 평균값을 계산합니다.
unpaired T-test 및 one-way ANOVA를 사용하여 각 시점에서 야생형 및 돌연변이 라인의 수화 데이터를 분석하여 특정 관심 시점의 평균을 비교합니다. 모든 시점에 걸쳐 평균을 비교하려면 여러 시점에 걸쳐 야생형 라인과 돌연변이 라인 간에 여러 T-검정을 수행합니다. 서로 다른 날에 수집된 야생형 식물에 대한 꽃가루 수화 시계열 데이터는 모든 시점에 대한 반복 사이의 평균에 대한 최소값과 최대값이 3% 이내임을 보여주었습니다.이 야생형 수분에 대한 대표 데이터는 상대적으로 낮은 표본 수와 다른 날에 걸쳐 높은 수준의 일관성을 보여주었습니다.
