Begynn analysen ved å legge den merkede A.thaliana pollenmottakerplanten på siden, og plasser den emasculated blomsten på scenen av et omvendt mikroskop for å avbilde stigmaet. For å fikse posisjonen til den emasculated mottakerblomsten, immobiliser stammen ved hjelp av strimler av maskeringstape. Fra pollendonorplanten, fjern en sunn og nyåpnet blomst og legg pollendonorplanten under et dissekerende mikroskop.
Samle pollenkorn ved hjelp av fintippede tang. Fjern overflødig pollenkorn ved å berøre tangen lett mot donorbladene til pollenkornets monolag dannes. Gå tilbake til pollenmottakerplanten og bruk en objektivlinse med lav effekt for å fokusere det inverterte mikroskopet på stigmaet.
Hold tangen langs åpningen mellom armene på tangen, forsiktig tilnærming og unpollinated stigmatisk papilla celle. Fortsett å nærme deg den ubestøvede stigmatiske papillacellen til det passende plasserte pollenkornet på tangen gir lett kontakt med overflaten. Når pollenvedlegg er bekreftet, trekk sakte tangen.
Orienter pollenkornet med ekvatorialaksen synlig og i skarpt fokus, og bytt umiddelbart til en objektivlinse med høyere effekt, som 20x. Ta det første pollenkornbildet som T-0, og fortsett å ta bilder med ett minutts mellomrom i 10 minutter. Juster fokuset for å imøtekomme små bevegelser i pollenkornet eller stigmaet.
Registrer rommets omgivelsestemperatur og relative fuktighet hvert annet minutt, slik at fremtidige sammenligninger mellom eksperimentelle replikater. Lagre bildene i et tapsfritt format, for eksempel ND2, før du gjentar pollinerings- og avbildningstrinnene for ytterligere pollenkorn for å skaffe data for kontroll og eksperimentelle pollineringer. Begynn datamålingene for pollenhydreringsanalyse ved hjelp av bildeanalyseprogramvare.
Bruk lignende parametere for digital zoom og tilnærmingen som definerer pollengrensen for alle målinger i datasettene. Registrer verdiene for den semimindre aksen for alle tidspunkter i datasettet. Når målingene er fullført for et datasett, eksporterer du de rå semiminorakseverdiene for hvert enkelt tidspunkt til et regneark.
Presenter dataene i kolonner per bildestakk, og beregn den prosentvise endringen i den prosentvise halvaksen. Gjenta trinnene og få data fra minst 15 hydrerte pollenkorn for hver plantelinje. Noen pollenkorn kan ikke hydrere eller kan hydrere betydelig langsommere enn forventet.
De er kjent som dud grains. Utelat disse fra datasettet. Beregn middelverdiene for hvert tidspunkt per plante ved hjelp av den spesialiserte programvarepakken GraphPad Prism.
Analyser hydreringsdata fra villtype- og mutantlinjer ved hvert tidspunkt ved hjelp av upparet T-test og enveis ANOVA for å sammenligne midlene til det spesifikke interessepunktet. For å sammenligne gjennomsnittet over alle tidspunktene, utfør flere T-tester mellom villtype og mutantlinjer over flere tidspunkter. Pollenhydreringstidsseriedataene for villtypeplanter samlet på forskjellige dager viste at minimums- og maksimumsverdiene for gjennomsnittet mellom replikater for alle tidspunkter var innenfor 3%Denne representative data for villtypepollineringer viste en høy grad av konsistens for relativt lave prøvetall og på tvers av forskjellige dager.
