Inicie o ensaio colocando a planta receptora de pólen marcada de A. thaliana de lado, posicionando a flor emasculada no palco de um microscópio invertido para obter imagens do estigma. Para fixar a posição da flor receptora emasculada, imobilize o caule com tiras de fita adesiva. Da planta doadora de pólen, remova uma flor saudável e recém-aberta e coloque a planta doadora de pólen sob um microscópio dissecante.
Reúna os grãos de pólen usando pinças de ponta fina. Remova o excesso de grãos de pólen tocando levemente a pinça contra as pétalas doadoras até que a monocamada do grão de pólen seja formada. Retorne à planta receptora de pólen e use uma lente objetiva de baixa potência para focar o microscópio invertido no estigma.
Segurando a pinça ao longo da abertura entre os braços da pinça, aproxime-se cuidadosamente e não polinize a célula da papila estigmatizada. Continue se aproximando da célula da papila estigmática não polinizada até que o grão de pólen adequadamente posicionado na pinça faça contato leve com sua superfície. Uma vez confirmada a fixação do pólen, retire lentamente a pinça.
Oriente o grão de pólen com seu eixo equatorial visível e em foco nítido, e mude imediatamente para uma lente objetiva de maior potência, como 20x. Capture a primeira imagem de grão de pólen como T-0 e continue capturando imagens em intervalos de um minuto por 10 minutos. Ajuste o foco para acomodar pequenos movimentos no grão de pólen ou estigma.
Registrar a temperatura ambiente e a umidade relativa da sala a cada dois minutos, permitindo futuras comparações entre réplicas experimentais. Salve as imagens em um formato sem perdas, como ND2, antes de repetir as etapas de polinização e imagem para grãos de pólen adicionais para adquirir dados para controle e polinizações experimentais. Iniciar as medições de dados para o ensaio de hidratação do pólen usando um software de análise de imagem.
Use parâmetros semelhantes de zoom digital e a abordagem que define o limite de pólen para todas as medições nos conjuntos de dados. Registre os valores do semieixo secundário para todos os pontos de tempo no conjunto de dados. Depois que as medições estiverem concluídas para um conjunto de dados, exporte os valores brutos do semieixo menor de cada ponto de tempo individual para uma planilha.
Apresente os dados em colunas por pilha de imagens e calcule a porcentagem de alteração de semieixo menor. Repita as etapas e obtenha dados de pelo menos 15 grãos de pólen hidratados para cada linhagem de planta. Alguns grãos de pólen podem não se hidratar ou podem se hidratar significativamente mais lentamente do que o esperado.
Eles são conhecidos como dud grains. Exclua-os do conjunto de dados. Calcule os valores médios para cada ponto de tempo por planta usando o pacote de software especializado GraphPad Prism.
Analise os dados de hidratação de linhas selvagens e mutantes em cada ponto de tempo usando o teste T não pareado e ANOVA unidirecional para comparar as médias do ponto de tempo específico de interesse. Para comparar as médias em todos os pontos de tempo, execute vários testes T entre linhas selvagens e mutantes em vários pontos de tempo. Os dados da série temporal de hidratação polínica para plantas selvagens coletados em diferentes dias mostraram que os valores mínimo e máximo para as médias entre réplicas para todos os momentos estavam dentro de 3%Estes dados representativos para polinizações selvagens demonstraram um alto grau de consistência para números de amostras relativamente baixos e em diferentes dias.
