Начните анализ с того, что положите меченое растение-реципиент пыльцы A.thaliana на бок, поместив выхолощенный цветок на сцену перевернутого микроскопа, чтобы отобразить рыльце. Чтобы зафиксировать положение выхолощенного цветка-реципиента, обездвижьте стебель с помощью полосок малярного скотча. Из растения-донора пыльцы удалите здоровый и только что раскрывшийся цветок и поместите растение-донор пыльцы под препарирующий микроскоп.
Соберите пыльцевые зерна с помощью щипцов с тонкими наконечниками. Удалите лишние пыльцевые зерна, слегка прикасаясь щипцами к лепесткам-донорам, пока не образуется монослой пыльцевого зерна. Вернитесь к растению-реципиенту пыльцы и используйте линзу объектива с низким энергопотреблением, чтобы сфокусировать перевернутый микроскоп на рыльце.
Проводя щипцами вдоль отверстия между плечами щипцов, осторожно подойдите и к неопыленной клеточке рыльца сосочка. Продолжайте приближаться к неопыленной ячейке рыльца сосочка до тех пор, пока правильно расположенное пыльцевое зерно на щипцах не вступит в легкий контакт с его поверхностью. Как только прикрепление пыльцы будет подтверждено, медленно извлеките щипцы.
Сориентируйте пыльцевое зерно так, чтобы его экваториальная ось была видна и находилась в резком фокусе, и сразу же переключитесь на объектив более высокой мощности, например 20x. Захватите первое изображение пыльцевого зерна как T-0 и продолжайте делать снимки с интервалом в одну минуту в течение 10 минут. Отрегулируйте фокус, чтобы приспособиться к небольшим движениям пыльцевого зерна или рыльца.
Записывайте температуру окружающей среды и относительную влажность в помещении каждые две минуты, что позволит в будущем сравнивать экспериментальные копии. Сохраните изображения в формате без потерь, например ND2, прежде чем повторять этапы опыления и визуализации дополнительных пыльцевых зерен для получения данных для контроля и экспериментального опыления. Начните измерения данных для анализа гидратации пыльцы с помощью программного обеспечения для анализа изображений.
Используйте аналогичные параметры цифрового зума и подход, определяющий границу пыльцы для всех измерений в наборах данных. Запишите значения полумалых осей для всех моментов времени в наборе данных. После завершения измерений для набора данных экспортируйте необработанные значения полумалых осей каждой отдельной точки времени в электронную таблицу.
Представьте данные в столбцах для каждого стека изображений и вычислите процентное изменение полуминорной оси. Повторите шаги и получите данные не менее чем из 15 гидратированных пыльцевых зерен для каждой линии растений. Некоторые пыльцевые зерна могут не гидратироваться или увлажняться значительно медленнее, чем ожидалось.
Они известны как пустые зерна. Исключите их из набора данных. Рассчитайте средние значения для каждого момента времени для каждого растения с помощью специализированного программного пакета GraphPad Prism.
Проанализируйте данные о гидратации от линий дикого типа и мутантных линий в каждый момент времени, используя непарный Т-критерий и односторонний ANOVA для сравнения средних значений конкретной интересующей точки времени. Чтобы сравнить средние значения по всем временным точкам, выполните несколько T-тестов между линиями дикого типа и мутантными линиями в несколько временных точек. Данные временных рядов гидратации пыльцы для растений дикого типа, собранные в разные дни, показали, что минимальные и максимальные значения средних значений между репликациями для всех моментов времени были в пределах 3%Эти репрезентативные данные для опыления дикого типа продемонстрировали высокую степень согласованности при относительно низком количестве выборок и в разные дни.
