Börja analysen genom att lägga den märkta A.thaliana pollenmottagaranläggningen på sin sida, placera den emasculerade blomman på scenen i ett inverterat mikroskop för att avbilda stigmatiseringen. För att fixa positionen för den emasculerade mottagarblomman, immobilisera stammen med remsor av maskeringstejp. Från pollendonatorplantan, ta bort en frisk och nyöppnad blomma och placera pollengivarväxten under ett dissekeringsmikroskop.
Samla pollenkorn med finspetsad pincett. Ta bort överskott av pollenkorn genom att lätt röra tången mot givarbladen tills pollenkornets monolager bildas. Gå tillbaka till pollenmottagaranläggningen och använd en mållins med låg effekt för att fokusera det inverterade mikroskopet på stigmatiseringen.
Håll pincetten längs öppningen mellan pincettens armar, försiktigt närma sig och obestämd stigmatisk papillcell. Fortsätt närma dig den opollinerade stigmatiska papillcellen tills det lämpligt placerade pollenkornet på pincetten gör lätt kontakt med dess yta. När pollenfästet har bekräftats, dra långsamt tillbaka pincetten.
Orientera pollenkornet med sin ekvatorialaxel synlig och i skarpt fokus och byt omedelbart till en objektivlins med högre effekt, som 20x. Ta den första pollenkornbilden som T-0 och fortsätt ta bilder med en minuts intervall i 10 minuter. Justera fokus för att rymma små rörelser i pollenkornet eller stigmat.
Registrera rummets omgivningstemperatur och relativa luftfuktighet varannan minut, vilket möjliggör framtida jämförelser mellan experimentella replikat. Spara bilderna i ett förlustfritt format, till exempel ND2, innan du upprepar pollinerings- och avbildningsstegen för ytterligare pollenkorn för att hämta data för kontroll och experimentella pollineringar. Börja datamätningarna för pollenhydreringsanalys med hjälp av bildanalysprogramvara.
Använd liknande parametrar för digital zoom och metoden som definierar pollengränsen för alla mätningar i datauppsättningarna. Registrera semiminor-axelvärdena för alla tidpunkter i datauppsättningen. När mätningarna är klara för en datauppsättning exporterar du de råa semiminor-axelvärdena för varje enskild tidspunkt till ett kalkylblad.
Presentera data i kolumner per bildstapel och beräkna den procentuella semiminor-axeländringen. Upprepa stegen och få data från minst 15 hydratiserade pollenkorn för varje växtlinje. Några pollenkorn kan misslyckas med att hydrera eller kan hydrera betydligt långsammare än förväntat.
De är kända som dud korn. Exkludera dessa från datauppsättningen. Beräkna medelvärdena för varje tidpunkt per anläggning med hjälp av det specialiserade mjukvarupaketet GraphPad Prism.
Analysera hydratiseringsdata från vildtyps- och mutantlinjer vid varje tidpunkt med hjälp av oparad T-test och envägs ANOVA för att jämföra medelvärdet för den specifika tidpunkten av intresse. För att jämföra medelvärdena över alla tidpunkter, utför flera T-tester mellan vildtyp och mutantlinjer över flera tidpunkter. Pollenhydreringstidsseriedata för vildtypsväxter som samlats in på olika dagar visade att minimi- och maximivärdena för medelvärdet mellan replikaten för alla tidpunkter låg inom 3% Dessa representativa data för vildtypspollineringar visade en hög grad av konsistens för relativt låga provnummer och över olika dagar.
