Tahliye, etiketli A.thaliana polen alıcı bitkisini yan tarafına koyarak, damgalamayı görüntülemek için iğdiş edilmiş çiçeği ters çevrilmiş bir mikroskop sahnesine yerleştirerek başlayın. Haş edilen alıcı çiçeğin konumunu sabitlemek için, maskeleme bandı şeritleri kullanarak sapı hareketsiz hale getirin. Polen donör bitkisinden, sağlıklı ve taze açılmış bir çiçeği çıkarın ve polen donör bitkisini diseksiyon mikroskobu altına yerleştirin.
İnce uçlu forseps kullanarak polen taneleri toplayın. Polen tanesinin tek katmanı oluşana kadar forsepslere donör yapraklarına hafifçe dokunarak fazla polen tanelerini çıkarın. Polen alıcı tesise geri dönün ve ters çevrilmiş mikroskobu damgalamaya odaklamak için düşük güçlü bir objektif lens kullanın.
Forsepsleri forsepsin kolları arasındaki açıklık boyunca tutarak, dikkatlice yaklaşın ve tozlaşmamış stigmatik papilla hücresi. Forseps üzerinde uygun şekilde yerleştirilmiş polen tanesi yüzeyiyle hafif temas edene kadar tozlaşmamış stigmatik papilla hücresine yaklaşmaya devam edin. Polen bağlanması onaylandıktan sonra, forsepsleri yavaşça geri çekin.
Polen tanesini ekvator ekseni görünür ve keskin bir odakta olacak şekilde yönlendirin ve hemen 20x gibi daha yüksek güçlü bir objektif lense geçin. İlk polen tanesi görüntüsünü T-0 olarak yakalayın ve 10 dakika boyunca bir dakikalık aralıklarla görüntü yakalamaya devam edin. Polen tanesi veya damgalamadaki küçük hareketlere uyum sağlamak için odağı ayarlayın.
Odanın ortam sıcaklığını ve bağıl nemi her iki dakikada bir kaydederek deneysel kopyalar arasında gelecekteki karşılaştırmalara izin verin. Kontrol ve deneysel tozlaşmalar için veri elde etmek üzere ek polen taneleri için tozlaşma ve görüntüleme adımlarını tekrarlamadan önce görüntüleri ND2 gibi kayıpsız bir biçimde kaydedin. Görüntü analiz yazılımını kullanarak polen hidrasyon testi için veri ölçümlerine başlayın.
Benzer dijital yakınlaştırma parametrelerini ve veri kümelerindeki tüm ölçümler için polen sınırını tanımlayan yaklaşımı kullanın. Veri kümesindeki tüm zaman noktaları için yarı ikincil eksen değerlerini kaydedin. Bir veri kümesi için ölçümler tamamlandıktan sonra, her bir zaman noktasının ham yarı ikincil eksen değerlerini bir elektronik tabloya aktarın.
Verileri görüntü yığını başına sütunlar halinde sunun ve yarı küçük eksen değişiminin yüzdesini hesaplayın. Adımları tekrarlayın ve her bitki hattı için en az 15 hidratlanmış polen tanesinden veri elde edin. Birkaç polen tanesi hidratlanamayabilir veya beklenenden önemli ölçüde daha yavaş hidratlanabilir.
Onlar dud taneleri olarak bilinir. Bunları veri kümesinden hariç tutun. Özel yazılım paketi GraphPad Prism'i kullanarak tesis başına her zaman noktası için ortalama değerleri hesaplayın.
İlgilenilen belirli zaman noktasının araçlarını karşılaştırmak için eşleştirilmemiş T-testi ve tek yönlü ANOVA kullanarak her zaman noktasında vahşi tip ve mutant çizgilerden gelen hidrasyon verilerini analiz edin. Araçları tüm zaman noktalarında karşılaştırmak için, birden fazla zaman noktasında vahşi tip ve mutant çizgiler arasında birden fazla T-testi gerçekleştirin. Farklı günlerde toplanan vahşi tip bitkiler için polen hidrasyon zaman serisi verileri, tüm zaman noktaları için replikalar arasındaki araçlar için minimum ve maksimum değerlerin% 3 içinde olduğunu göstermiştir Vahşi tip tozlaşmalar için bu temsili veriler, nispeten düşük numune sayıları için ve farklı günlerde yüksek derecede tutarlılık göstermiştir.
