Pour commencer, incuber les œufs de poule fécondés dans un incubateur à œufs humidifié avec l’extrémité pointue vers le bas à 37,5 degrés Celsius. Le sixième jour d’incubation, ou E5, stérilisez la coquille d’œuf en la pulvérisant avec de l’éthanol à 70%. À l’aide d’un chandelier à œufs, tracez le long du périmètre de l’espace aérien au-dessus de l’embryon avec un crayon et couvrez la zone délimitée avec du ruban adhésif transparent.
Couper doucement autour de la zone tracée avec des ciseaux incurvés sans couper dans les membranes embryonnaires ou les vaisseaux sanguins. Jetez le haut de la coquille d’œuf. Ajoutez quelques gouttes de milieu de culture saline ou cellulaire sur la membrane de l’espace aérien pour la mouiller afin qu’elle se détache facilement.
À l’aide de pinces fines, percez soigneusement la membrane de l’espace aérien sur le dessus de l’embryon. Retirez-le. Prenez la membrane amnion transparente qui entoure immédiatement l’embryon pour positionner la tête et injectez environ 50 000 cellules dans cinq microlitres de milieux de culture cellulaire appropriés dans le tectum optique avec une micropipette en verre et une pompe pneumatique PicoPump.
Ajouter quelques gouttes de 50 milligrammes par millilitre d’ampicilline sur le dessus de l’embryon et couvrir le trou dans le haut des œufs avec du ruban adhésif transparent. Placez-les dans un incubateur d’œufs humidifié jusqu’à E15 pour la dissection. Les tumeurs qui se sont formées dans le tectum optique E5 in vivo après l’injection de glioblastome, ou cellules souches GBM, ou GSC exprimant la protéine fluorescente verte à E15 sont montrées dans cette figure.
Les GSC se fixent à la surface ventriculaire et forment des tumeurs invasives dans la paroi cérébrale. Quatre couleurs ont été utilisées pour identifier cinq caractéristiques dans cette expérience, les GSC verts, les noyaux blancs, les vaisseaux sanguins blancs, l’intégrine alpha-6 bleue et la Nestine rouge SOX2 ou rouge. Ces chiffres montrent que les GSC résident dans vos vaisseaux sanguins et semblent migrer le long de ceux-ci.
Des films de rendus de volume 3D rotatifs sur des tranches fixes et immunocolorées de tumeurs GSC in vivo sont montrés ici.
