Para começar, incube os ovos de galinha fertilizados em uma incubadora de ovos umidificada com a extremidade pontiaguda voltada para baixo a 37,5 graus Celsius. No sexto dia de incubação, ou E5, esterilizar a casca do ovo pulverizando-a com etanol 70%. Usando um veleiro de ovo, trace ao longo do perímetro do espaço aéreo acima do embrião com um lápis e cubra a área delineada com fita transparente.
Corte suavemente ao redor da área traçada com tesoura curva sem cortar as membranas embrionárias ou vasos sanguíneos. Descarte a parte superior da casca do ovo. Adicione algumas gotas de soro fisiológico ou meio de cultura celular na membrana do espaço aéreo para molhá-la para que ela se desprenda facilmente.
Usando pinças finas, perfure cuidadosamente a membrana do espaço aéreo sobre a parte superior do embrião. Removê-lo. Pegue a membrana de âmnio transparente que envolve imediatamente o embrião para posicionar a cabeça e injete cerca de 50.000 células em cinco microlitros de meio de cultura celular adequado no tecto óptico com uma micropipeta de vidro e uma PicoPump pneumática.
Adicione algumas gotas de 50 miligramas por mililitro de ampicilina em cima do embrião e cubra o buraco na parte superior dos ovos com fita adesiva. Colocá-los em incubadora de ovos umedecida até E15 para dissecção. Os tumores que se formaram no tecto óptico E5 in vivo após a injeção de glioblastoma, ou células-tronco GBM, ou GSCs expressando proteína fluorescente verde em E15 são mostrados nesta figura.
As GSCs se ligam à superfície ventricular e formam tumores invasivos na parede cerebral. Quatro cores foram usadas para identificar cinco características neste experimento, GSCs verdes, núcleos brancos, vasos sanguíneos brancos, integrina alfa-6 azul e SOX2 vermelho ou Nestin vermelho. Esses números mostram que os GSCs residem em seus vasos sanguíneos e parecem estar migrando ao longo deles.
Filmes de renderização de volume 3D rotativo para fatias fixas e imunocoradas de tumores GSC in vivo são mostrados aqui.
