Для начала инкубируйте оплодотворенные куриные яйца в увлажненном инкубаторе для яиц заостренным концом вниз при температуре 37,5 градусов Цельсия. На шестой день инкубации, или Е5, стерилизуют яичную скорлупу, опрыскав ее 70%-ным этанолом. С помощью свечи для яиц обведите карандашом по периметру воздушного пространства над зародышем и заклейте очерченный участок прозрачным скотчем.
Аккуратно обрежьте прорисованный участок изогнутыми ножницами, не разрезая эмбриональные оболочки или кровеносные сосуды. Выбросьте верхнюю часть яичной скорлупы. Добавьте несколько капель физиологического раствора или среды для культивирования клеток на мембрану воздушного пространства, чтобы смочить ее, чтобы она легко отделилась.
С помощью тонких щипцов осторожно проткните мембрану воздушного пространства над верхней частью эмбриона. Удалите его. Возьмите прозрачную мембрану амниона, которая непосредственно окружает эмбрион, чтобы расположить голову, и введите около 50 000 клеток в пяти микролитрах подходящей среды для культивирования клеток в оптический тектум с помощью стеклянной микропипетки и пневматического пиконасоса.
Добавьте несколько капель 50 миллиграммов на миллилитр ампициллина поверх эмбриона и закройте отверстие в верхней части яиц прозрачной лентой. Поместите их в увлажненный инкубатор для яиц до Е15 для вскрытия. На этом рисунке показаны опухоли, которые образовались в тектуме зрительного нерва E5 in vivo после инъекции глиобластомы, или стволовых клеток GBM, или GSC, экспрессирующих зеленый флуоресцентный белок на E15.
ГСК прикрепляются к поверхности желудочков и образуют инвазивные опухоли в стенке головного мозга. Четыре цвета были использованы для идентификации пяти признаков в этом эксперименте: зеленые GSC, белые ядра, белые кровеносные сосуды, синий интегрин альфа-6 и либо красный SOX2, либо красный нестин. Эти цифры показывают, что GSC находятся в ваших кровеносных сосудах и, по-видимому, мигрируют вдоль них.
Здесь показаны видеоролики с вращающимся объемным 3D-рендерингом фиксированных и иммуноокрашенных срезов опухолей GSC in vivo.
