Nadat u de geënucleeerde oogbol van de geëuthanaseerde muis hebt bevestigd, brengt u deze over naar een glazen dia en plaatst u deze onder een ontleedmicroscoop. Klem met een tang de rand van het hoornvlies vast om oogbolbewegingen te voorkomen. Knip met de ontleedschaar rond het hoornvlies op een diepte van ongeveer een millimeter door de sclerale limbus van het hoornvlies en verwijder vervolgens de lens en het glasachtig lichaam.
Houd de optische schijf in het midden en snijd het netvlies radiaal langs de vier kwadranten en bereik ongeveer 2/3 van de straal van het netvlies. Klem een van de sclerale randen vast met een getande tang. Houd de sclerarand vast met een niet-getande tang en beweeg van de getande tang naar de sclerabasis.
Pel voorzichtig het netvlies. Maak het netvlies nat met 200 microliter PBS met behulp van een pipet. Verwijder overtollige PBS met absorberend papier en druk het netvlies indien nodig plat met een kleine borstel.
Voeg langzaam druppelsgewijs koude methanol toe aan het binnenoppervlak van het netvlies totdat het volledig bedekt is. Zodra het netvlies wit wordt en een verhoogde vasthoudendheid ontwikkelt, vlakt u het netvlies voorzichtig af en verwijdert u onzuiverheden, zoals resterende pigmentmembranen en het glasachtig lichaam, met een kleine borstel. Na het omkeren van het netvlies, behandel het met methanol zoals eerder aangetoond en breng het over in een put van 24 putplaat, week het in methanol en bewaar het bij 20 graden Celsius gedurende één tot twee uur voor onmiddellijke immunostaining.
Spoel vervolgens het netvlies met PBS na het verwijderen van methanol van de plaat. De retinol ganglioncellen van de netvliezen voor en na methanolbehandeling werden gevisualiseerd met behulp van confocale microscopie, wat aangaf dat de 12 maanden methanolbehoud geen invloed hadden op de RGC-immunokleuring.
