Name: Affinity Chromatography Mediated Fibrinolytic Enzymes Purification from Crude Protein Extracts
Uploaded: 2023-06-02T12:10:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Affinity Chromatography Mediated Fibrinolytic Enzymes Purification from Crude Protein Extracts at JoVE.com

affinity chromatography mediated fibrinolytic enzymes purification from crude protein extracts 

تنقية إنزيم تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus عبر كروماتوغرافيا التقارب

Thrombosis is a major threat to public health, especially following the Covid-19 global pandemic1,2. Clinically, many plasminogen activators (PAs), such as tissue-type plasminogen activator (tPA) and urokinase (UK), have been widely used as thrombolytic drugs. PAs can activate patients&#39; plasminogen into active plasmin to degrade fibrin. Thus, their thrombolytic efficiency is heavily restricted by the patients&#39; plasminogen status3,4. Fibrinolytic agents, such as metalloproteinase plasmin and serine plasmin, are another type of clinical thrombolytic drug that also include fibrinolytic enzymes (FE) such as plasmin, which can dissolve clots directly but are quickly inactivated by various plasmin inhibitors5. Subsequently, a novel type of fibrinolytic agent has been reported that can dissolve the thrombus by not only activating the plasminogen into plasmin but also degrading the fibrin directly6-the fibrinolytic enzyme from the ancient peanut worm Sipunculus nudus (sFE)6. This bifunction endows sFE other advantages over traditional thrombolytic drugs, especially in terms of abnormal plasminogen status. Compared with other bifunctional fibrinolytic agents7,8,9, sFE displays several advantages, including safety, over non-food derived agents for drug development, especially for oral drugs. This is because the biosafety and biocompatibility of Sipunculus nudus have been well-established10.
Similar to the other natural fibrinolytic agents isolated from microorganisms, earthworms, and mushrooms, the purification of sFE from S. nudus is very complicated and includes multiple stages, such as tissue homogenization, ammonium sulphate precipitation, desalination, anion-exchange chromatography, hydrophobic interaction chromatography, and molecular sieving10,11,12. Such a purification system not only depends on proficient skills and expensive materials, but also requires several days to complete the whole procedure. Therefore, a simple purification program of sFE is of great significance for the further development of sFE. Fortunately, two crystals of sFE (PDB: 8HZP; PDB: 8HZO) have been successfully obtained (see Supplemental File 1 and Supplemental File 2). Through structural analysis and molecular docking experiments, we found that the catalytic core of sFE could specifically bind to targets containing arginine or lysine residues.
Herein, an affinity purification system was proposed for the first time, based on the crystal structure of sFE. By following this protocol, highly pure and highly active sFE could be purified from the crude extracts in a single affinity purification stage. The protocol developed here is not only important for the large scale preparation of sFE, but also may be applied for the purification of other fibrinolytic agents.

تسليط الضوء على المؤلف: تنقية تقارب إنزيم تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus  

تنقية التقارب لإنزيم تحلل الفيبرين من Sipunculus nudus

Our research is mainly about the purification of fibrinolytic enzyme. This work tries to establish a simple purification method for fibrinolytic enzyme. In this work, we report an arginine or lysine best-affinity purification system of fibrinolytic enzyme for the first time.Compared with the conventional purification methods, this is a simple, inexpensive, and efficient approach for the purification of fibrinolytic enzymes from Sipunculus nudus. The development of this protocol is of greater significance for the further utilization of fibrinolytic enzymes from Sipunculus nudus and other similar agents.

Watch this Scientific Journal Video about Affinity Chromatography Mediated Fibrinolytic Enzymes Purification from Crude Protein Extracts at JoVE.com

Affinity Chromatography Mediated Fibrinolytic Enzymes Purification from Crude Protein Extracts   

كروماتوغرافيا التقارب بوساطة تنقية إنزيمات تحلل الفيبرين من مستخلصات البروتين الخام 

قم بتصفية البروتينات الخام المستخرجة من أمعاء Sipunculus nudus من خلال غشاء مرشح 0.22 ميكرومتر. قم بتخزين هذه العينة في أربع درجات سلزية لاستخدامها لاحقا. قم بتعبئة عمود كروماتوغرافيا تقارب مصفوفة أغاروز أرجينين عن طريق تحميل وسط مصفوفة أغاروز أرجينين في عمود كروماتوغرافي فارغ سعة خمسة ملليلترات.وبالمثل ، قم بتحميل عمود كروماتوغرافيا تقارب مصفوفة الأغاروز ليسين عن طريق تحميل وسط مصفوفة الأغاروز ليسين في عمود كروماتوغرافي فارغ. وازن أعمدة كروماتوغرافيا التقارب مع الماء المقطر المزدوج متبوعا بمحلول ثلاثي هيدروكلوريد. قم بتحميل عينة البروتين المفلترة على العمود المتوازن مسبقا.اغسل العمود بخمسة مجلدات من محلول 0.02-molar tris hydrochloride قبل استنشاقه بمحلول كلوريد الصوديوم 0.15-0.25-0.35-0.45-0.55 و 0.65-molar ، على التوالي. بمجرد ظهور قمة الشطف في شطف كلوريد الصوديوم 0.15 مولار ، اجمع الكسور في أنابيب سعة خمسة ملليلترات. ركز عينة الشطف باستخدام مرشح طرد مركزي فائق ثلاثي كيلودالتون وقم بتخزين هذه العينة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر لاستخدامها لاحقا.عندما تم تحميل محلول البروتين على عمود تقارب مصفوفة أغاروز الأرجينين ، ظهرت ذروة التدفق من حوالي 40 إلى 66 دقيقة. في مرحلة الشطف المتدرج ، بلغ الشطف مع كلوريد الصوديوم 0.15 مولار ذروته من حوالي 94 إلى 110 دقيقة. عندما تم تحميل محلول البروتين إلى عمود تقارب مصفوفة الأغاروز ليسين ، ظهرت ذروة التدفق من حوالي 38 إلى 60 دقيقة.في مرحلة الشطف المتدرج ، بلغ الشطف مع كلوريد الصوديوم 0.15 مولار ذروته من 80 إلى 86 دقيقة.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Affinity Chromatography Mediated Fibrinolytic Enzymes Purification from Crude Protein Extracts 

Affinity Purification of a Fibrinolytic Enzyme from Sipunculus nudus

The fibrinolytic enzyme from Sipunculus nudus (sFE) is a novel fibrinolytic agent that can both activate plasminogen into plasmin and degrade fibrin ...