للبدء ، تنزلق خلايا HEK293A البذور الموجودة على الغطاء اللامع في صفيحة بئر مكونة من 24 بئرا تحتوي على نسبة عالية من الجلوكوز DMEM حتى تصبح متقاربة بنسبة 80٪. في اليوم التالي ، تجويع الخلايا لمدة ساعتين في محلول ملح إيرل المتوازن. بعد العلاج ، استنشاق الوسط وإضافة 500 ميكرولتر أو 4 ٪ محلول الفورمالديهايد في برنامج تلفزيوني واحتضان لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإصلاح الخلايا.
بعد التثبيت ، استبدل محلول الفورمالديهايد ب 500 ميكرولتر من PBS. بعد ذلك ، قم بإخماد مجموعة الألدهيد الحرة بإضافة 500 ميكرولتر من محلول كلوريد الأمونيوم 50 مللي مولار في PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. استبدل محلول كلوريد الأمونيوم ب 500 ميكرولتر من محلول 50 ميكروغرام لكل مليلتر ديجيتونين في برنامج تلفزيوني لمدة خمس دقائق لاختراق الخلايا.
بعد النفاذية ، استبدل محلول الديجيتونين ب 500 ميكرولتر من PBS تكرار غسل PBS ثلاث مرات. بعد الغسيل الأخير ، احتضان الخلايا في 500 ميكرولتر من محلول الحجب لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. بعد الحضانة ، استبدل محلول الحجب ب 500 ميكرولتر من PBS.
بعد ذلك باستخدام الملقط ، اجمع زلات الغطاء من البئر وقم بإزالة PBS الزائدة باستخدام مناديل الأنسجة الرقيقة. في الحجرة المرطبة ، ضع غطاء الانزلاق برفق مع جانب الخلية لأسفل على قطرة 50 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية. احتضان الخلايا في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة في درجة حرارة الغرفة.
بعد الحضانة ، اجمع زلات الغطاء واستنزاف محلول الأجسام المضادة الأولية الزائدة. ضع الغطاء ينزلق مرة أخرى في لوحة البئر 24 مع جانب الخلية لأعلى واغسلها ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني. بعد الغسيل الأخير ، اجمع زلات الغطاء واستنزاف PBS الزائد قبل وضع كل زلة غطاء مع جانب الخلية لأسفل على قطرة 50 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوي.
احتضان في غرفة رطبة لمدة ساعة واحدة. بعد الحضانة ، قم بتصريف محلول الأجسام المضادة الثانوي الزائد واغسل انزلاق الغطاء ثلاث مرات باستخدام 500 ميكرولتر من PBS في لوحة البئر 24. بعد تصريف PBS الزائد ، ضع كل غطاء ينزلق مع جانب الخلية لأسفل على قطرة 50 ميكرولتر من محلول الخطافات المخفف من واحد إلى 4000 في PBS في غرفة مرطبة.
احتضان في غرفة رطبة لمدة خمس دقائق. بعد ذلك ، قم بإزالة محلول الخطافات الزائدة واغسل انزلاق الغطاء ثلاث مرات باستخدام برنامج تلفزيوني ومرة واحدة بالماء منزوع الأيونات في صفيحة بئر 24. بعد تصريف الماء الزائد منزوع الأيونات ، ضع كل غطاء ينزلق على قطرة من 10 إلى 20 ميكرولتر من محلول التركيب المرقط على شريحة مجهرية لتجنب تكوين فقاعات الهواء.
