Til at begynde med glider frø HEK293A celler på glansdæksel i en 24 brøndplade, der indeholder DMEM med høj glukose, indtil de bliver 80% sammenflydende. Den næste dag sultede cellerne i to timer i Earls afbalancerede saltopløsning. Efter behandling aspireres mediet og tilsættes 500 mikroliter eller 4% formaldehydopløsning i PBS og inkuberes i 20 minutter ved stuetemperatur for at fiksere cellerne.
Efter fiksering udskiftes formaldehydopløsningen med 500 mikroliter PBS. Sluk derefter den frie aldehydgruppe ved at tilsætte 500 mikroliter 50 millimolær ammoniumchloridopløsning i PBS i 10 minutter ved stuetemperatur. Udskift ammoniumchloridopløsningen med 500 mikroliter af en 50 mikrogram pr. milliliter digitoninopløsning i PBS i fem minutter for at permeabilisere cellerne.
Efter permeabilisering udskiftes digitoninopløsningen med 500 mikroliter PBS-gentagende PBS-vask tre gange. Efter den sidste vask inkuberes cellerne i 500 mikroliter blokeringsopløsning i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter inkubation udskiftes blokeringsopløsningen med 500 mikroliter PBS.
Brug derefter pincet, saml dækselsedlerne fra brønden og fjern overskydende PBS ved hjælp af tynde vævsservietter. I det befugtede kammer skal du forsigtigt lægge dækslet med cellesiden nedad på en 50 mikroliter dråbe primær antistofopløsning. Inkuber cellerne i et befugtet kammer i en time ved stuetemperatur.
Efter inkubation samles dækslerne og drænes af den overskydende primære antistofopløsning. Sæt dækslet tilbage i 24 brøndpladen med cellesiden opad og vask dem tre gange med PBS. Efter den sidste vask opsamles dækselsedlerne og drænes af overskydende PBS, inden hvert dæksel med cellesiden nedad placeres på en 50 mikroliter dråbe sekundær antistofopløsning.
Inkuber i et befugtet kammer i en time. Efter inkubation drænes den overskydende sekundære antistofopløsning og vaskes dækslet tre gange med 500 mikroliter PBS i 24 brøndpladen. Efter dræning af overskydende PBS skal du placere hvert dæksel glide med cellesiden nedad på en 50 mikroliter dråbe krogopløsning fortyndet en til 4.000 i PBS i et befugtet kammer.
Inkuber i et befugtet kammer i fem minutter. Fjern derefter opløsningen af overskydende kroge og vask dækslet tre gange med PBS og en gang med deioniseret vand i en 24 brøndplade. Efter dræning af overskydende deioniseret vand skal du placere hvert dæksel glide på en 10 til 20 mikroliter dråbe monteringsopløsning, der er spottet på et mikroskopglas, så dannelse af luftbobler undgås.