Om te beginnen zaai HEK293A cellen op glanzende afdekglaasjes die in een plaat met 24 putjes met DMEM met een hoog glucosegehalte zijn geplaatst totdat ze voor 80% samenvloeiend zijn. De volgende dag hebben de cellen twee uur lang uitgehongerd in Earl's uitgebalanceerde zoutoplossing. Aspireer na de behandeling het medium op en voeg 500 microliter of 4% formaldehyde-oplossing toe aan PBS en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur om de cellen te fixeren.
Vervang na fixatie de formaldehyde-oplossing door 500 microliter PBS. Blus vervolgens de vrije aldehydegroep door 500 microliter 50 millimolaire ammoniumchloride-oplossing toe te voegen aan PBS gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur. Vervang de ammoniumchloride-oplossing door 500 microliter van een 50 microgram per milliliter digitonine-oplossing in PBS gedurende vijf minuten om de cellen te permeabiliseren.
Vervang na permeabilisatie de digitonine-oplossing door 500 microliter PBS-herhaalde PBS-wasbeurt. Na de laatste wasbeurt de cellen gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur incuberen in 500 microliter blokkerende oplossing. Vervang na incubatie de blokkerende oplossing door 500 microliter PBS.
Verzamel vervolgens met een pincet de afdekglaasjes uit het putje en verwijder de overtollige PBS met dunne doekjes. Leg in de bevochtigde kamer het afdekglaasje voorzichtig met de celzijde naar beneden op een druppel van 50 microliter primaire antilichaamoplossing. Incubeer de cellen in een bevochtigde kamer gedurende een uur bij kamertemperatuur.
Verzamel na incubatie de dekglaasjes en laat de overtollige primaire antilichaamoplossing weglopen. Plaats de dekselglaasjes terug in de plaat met 24 putjes met de celzijde naar boven en was ze drie keer met PBS. Verzamel na de laatste wasbeurt de afdekglaasjes en laat het overtollige PBS weglopen voordat u elk afdekglaasje met de celzijde naar beneden op een druppel van 50 microliter secundaire antilichaamoplossing plaatst.
Incubeer gedurende een uur in een bevochtigde kamer. Giet na incubatie de overtollige secundaire antilichaamoplossing af en was het afdekglaasje drie keer met 500 microliter PBS in de plaat met 24 putjes. Nadat overtollig PBS is afgetapt, plaatst u elk afdekglaasje met de celzijde naar beneden op een druppel van 50 microliter hakenoplossing verdund tot 4.000 in PBS in een bevochtigde kamer.
Incubeer gedurende vijf minuten in een bevochtigde kamer. Verwijder vervolgens de overtollige hakenoplossing en was de afdekglaasjes drie keer met PBS en één keer met gedeïoniseerd water in een plaat met 24 putjes. Na het aftappen van overtollig gedeïoniseerd water, plaatst u elke afdekglaasje op een druppel montageoplossing van 10 tot 20 microliter die op een microscoopglaasje is gespot, zodat er geen luchtbellen ontstaan.