Pour commencer, semez HEK293A cellules sur des lamelles brillantes placées dans une plaque à 24 puits contenant un DMEM à haute teneur en glucose jusqu’à ce qu’elles deviennent confluentes à 80 %. Le lendemain, j’ai affamé les cellules pendant deux heures dans la solution saline équilibrée d’Earl. Après le traitement, aspirer le milieu et ajouter 500 microlitres ou une solution de formaldéhyde à 4 % dans du PBS et incuber pendant 20 minutes à température ambiante pour fixer les cellules.
Après fixation, remplacez la solution de formaldéhyde par 500 microlitres de PBS. Ensuite, trempez le groupe aldéhyde libre en ajoutant 500 microlitres de solution de chlorure d’ammonium à 50 millimolaires dans du PBS pendant 10 minutes à température ambiante. Remplacez la solution de chlorure d’ammonium par 500 microlitres d’une solution de digitonine de 50 microgrammes par millilitre dans du PBS pendant cinq minutes pour perméabiliser les cellules.
Après perméabilisation, remplacez la solution de digitonine par 500 microlitres de PBS en répétant le lavage PBS trois fois. Après le dernier lavage, incubez les cellules dans 500 microlitres de solution bloquante pendant 30 minutes à température ambiante. Après incubation, remplacez la solution bloquante par 500 microlitres de PBS.
Ensuite, à l’aide d’une pince à épiler, récupérez les lamelles de couverture du puits et retirez l’excédent de PBS à l’aide de lingettes en papier minces. Dans la chambre humidifiée, déposez délicatement la lamelle de protection avec le côté cellule vers le bas sur une goutte de 50 microlitres de solution d’anticorps primaires. Incuber les cellules dans une chambre humidifiée pendant une heure à température ambiante.
Après l’incubation, récupérez les lamelles de couverture et égouttez l’excès de solution d’anticorps primaire. Replacez les lamelles de couvercle dans la plaque à 24 puits, côté cellule vers le haut, et lavez-les trois fois avec du PBS. Après le dernier lavage, récupérez les lamelles et égouttez l’excès de PBS avant de placer chaque lamelle avec le côté cellulaire vers le bas sur une goutte de 50 microlitres de solution d’anticorps secondaire.
Incuber dans une chambre humidifiée pendant une heure. Après l’incubation, égouttez l’excès de solution d’anticorps secondaire et lavez la lamelle trois fois avec 500 microlitres de PBS dans la plaque à 24 puits. Après avoir égoutté l’excès de PBS, placez chaque lamelle de couverture avec le côté cellule vers le bas sur une goutte de 50 microlitres de solution de crochets diluée de un à 4 000 dans du PBS dans une chambre humidifiée.
Incuber dans une chambre humidifiée pendant cinq minutes. Ensuite, retirez l’excédent de solution de crochets et lavez les lamelles trois fois avec du PBS et une fois avec de l’eau déminéralisée dans une plaque à 24 puits. Après avoir vidé l’excès d’eau déminéralisée, placez chaque couvercle sur une goutte de 10 à 20 microlitres de solution de montage repérée sur une lame de microscope en évitant la formation de bulles d’air.
