शुरू करने के लिए, ग्लॉस कवर पर बीज HEK293A कोशिकाएं उच्च ग्लूकोज डीएमईएम युक्त 24 वेल प्लेट में तब तक रखी जाती हैं जब तक कि वे 80% कंफ्लुएंट न हो जाएं। अगले दिन, अर्ल के संतुलित नमक समाधान में दो घंटे के लिए कोशिकाओं को भूखा रखा। उपचार के बाद, माध्यम को एस्पिरेट करें और पीबीएस में 500 माइक्रोलीटर या 4% फॉर्मलाडेहाइड समाधान जोड़ें और कोशिकाओं को ठीक करने के लिए कमरे के तापमान पर 20 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें।
निर्धारण के बाद, फॉर्मलाडेहाइड समाधान को 500 माइक्रोलीटर पीबीएस के साथ बदलें। इसके बाद, कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए पीबीएस में 50 मिलीमोलर अमोनियम क्लोराइड समाधान के 500 माइक्रोलीटर जोड़कर मुक्त एल्डिहाइड समूह को बुझाएं। कोशिकाओं को स्थिर करने के लिए पांच मिनट के लिए पीबीएस में 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर डिजिटोनिन समाधान के 500 माइक्रोलीटर के साथ अमोनियम क्लोराइड समाधान को बदलें।
परमेबिलाइजेशन के बाद, डिजिटोनिन समाधान को पीबीएस के 500 माइक्रोलीटर के साथ तीन बार पीबीएस धोने के साथ बदलें। अंतिम धोने के बाद, कमरे के तापमान पर 30 मिनट के लिए ब्लॉकिंग घोल के 500 माइक्रोलीटर में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन के बाद, ब्लॉकिंग समाधान को 500 माइक्रोलीटर पीबीएस के साथ बदलें।
चिमटी का उपयोग करके, कुएं से कवर पर्ची एकत्र करें और पतले ऊतक पोंछे का उपयोग करके अतिरिक्त पीबीएस को हटा दें। ह्यूमिडिफायर चैंबर में, धीरे से प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान की 50 माइक्रोलीटर बूंद पर सेल साइड के साथ कवर स्लिप बिछाएं। कमरे के तापमान पर एक घंटे के लिए एक ह्यूमिडिफायर कक्ष में कोशिकाओं को इनक्यूबेट करें।
इनक्यूबेशन के बाद, कवर स्लिप इकट्ठा करें और अतिरिक्त प्राथमिक एंटीबॉडी समाधान को निकाल दें। कवर स्लिप को सेल साइड के साथ 24 वेल प्लेट में वापस रखें और उन्हें पीबीएस के साथ तीन बार धोएं। अंतिम धोने के बाद, कवर स्लिप एकत्र करें और द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान की 50 माइक्रोलीटर बूंद पर सेल साइड के साथ प्रत्येक कवर स्लिप को रखने से पहले अतिरिक्त पीबीएस को निकाल दें।
एक घंटे के लिए एक ह्यूमिडिफायर चैंबर में इनक्यूबेट करें। इनक्यूबेशन बाद, अतिरिक्त द्वितीयक एंटीबॉडी समाधान को निकाल दें और 24 वेल प्लेट में पीबीएस के 500 माइक्रोलीटर के साथ कवर स्लिप को तीन बार धोएं। अतिरिक्त पीबीएस को निकालने के बाद, प्रत्येक कवर स्लिप को सेल साइड के साथ एक ह्यूमिडिफायर चैंबर में पीबीएस में एक से 4,000 तक पतला हुक समाधान की 50 माइक्रोलीटर बूंद पर रखें।
पांच मिनट के लिए एक ह्यूमिडिफायर चैंबर में इनक्यूबेट करें। इसके बाद, अतिरिक्त हुक समाधान को हटा दें और कवर स्लिप को पीबीएस के साथ तीन बार और एक बार 24 कुएं की प्लेट में विआयनीकृत पानी से धो लें। अतिरिक्त विआयनीकृत पानी को निकालने के बाद, प्रत्येक कवर स्लिप को माइक्रोस्कोप स्लाइड पर देखे गए माउंटिंग घोल की 10 से 20 माइक्रोलीटर बूंद पर रखें ताकि हवा के बुलबुले के गठन से बचा जा सके।
