まず、グロスカバースリップ上のHEK293A細胞を、高グルコースDMEMを含む24ウェルプレートに入れ、80%コンフルエントになるまで播種します。翌日、アールの平衡塩溶液で2時間細胞を飢餓状態にした。処理後、培地を吸引し、PBSに500マイクロリットルまたは4%ホルムアルデヒド溶液を加え、室温で20分間インキュベートして細胞を固定します。
固定後、ホルムアルデヒド溶液を500マイクロリットルのPBSと交換します。次に、PBSに500マイクロリットルの50ミリモル塩化アンモニウム溶液を加えて、室温で10分間、遊離アルデヒド基をクエンチします。塩化アンモニウム溶液を500マイクロリットルの50マイクログラム/ミリリットルのジギトニン溶液とPBS溶液で5分間交換し、細胞を透過させます。
透過処理後、ジギトニン溶液を500マイクロリットルのPBSと交換し、PBS洗浄を3回繰り返します。最後の洗浄後、細胞を500マイクロリットルのブロッキング溶液中で室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、ブロッキング溶液を500マイクロリットルのPBSと交換します。
次に、ピンセットを使用して、ウェルからカバースリップを収集し、薄いティッシュワイプを使用して余分なPBSを取り除きます。加湿チャンバー内で、細胞側を下にしてカバースリップを50マイクロリットルの一次抗体溶液に静かに置きます。加湿チャンバー内で細胞を室温で1時間インキュベートします。
インキュベーション後、カバースリップを回収し、余分な一次抗体溶液を排出します。カバースリップをセル側を上にして24ウェルプレートに戻し、PBSで3回洗浄します。最後の洗浄後、カバースリップを回収し、余分なPBSを排出してから、各カバースリップを細胞側を下にして、50マイクロリットルの二次抗体溶液に滴下します。
加湿チャンバー内で1時間インキュベートします。インキュベーション後、余分な二次抗体溶液を排出し、24ウェルプレートで500マイクロリットルのPBSでカバースリップを3回洗浄します。余分なPBSを排出した後、加湿チャンバー内でPBSで1〜4, 000に希釈した50マイクロリットルのフック溶液に、セル側を下にして各カバースリップを置きます。
加湿チャンバー内で5分間インキュベートします。次に、余分なフック溶液を取り除き、カバースリップをPBSで3回、脱イオン水で1回、24ウェルプレートで洗浄します。余分な脱イオン水を排出した後、気泡の形成を避けて、顕微鏡スライドにスポットされた10〜20マイクロリットルの取り付け液滴に各カバースリップを置きます。