For å begynne, frø HEK293A celler på glansdeksel slips plassert i en 24 brønnplate som inneholder høy glukose DMEM til de blir 80% sammenflytende. Neste dag sultet cellene i to timer i Earls balanserte saltløsning. Etter behandling, aspirer mediet og tilsett 500 mikroliter eller 4% formaldehydoppløsning i PBS og inkuber i 20 minutter ved romtemperatur for å fikse cellene.
Etter fiksering, erstatt formaldehydoppløsningen med 500 mikroliter PBS. Deretter slukkes den frie aldehydgruppen ved å tilsette 500 mikroliter 50 millimolar ammoniumkloridoppløsning i PBS i 10 minutter ved romtemperatur. Bytt ut ammoniumkloridoppløsningen med 500 mikroliter av en 50 mikrogram per milliliter digitoninoppløsning i PBS i fem minutter for å permeabilisere cellene.
Etter permeabilisering, erstatt digitonin-løsningen med 500 mikroliter PBS som gjentar PBS-vask tre ganger. Etter siste vask, inkuber cellene i 500 mikroliter blokkerende løsning i 30 minutter ved romtemperatur. Etter inkubering, erstatt blokkeringsløsningen med 500 mikroliter PBS.
Deretter bruker du pinsett, samler dekselet glipper fra brønnen og fjerner overflødig PBS ved hjelp av tynne vevsservietter. I det fuktede kammeret legger du forsiktig ned dekselet med cellesiden ned på en 50 mikroliter dråpe primær antistoffløsning. Inkuber cellene i et fuktet kammer i en time ved romtemperatur.
Etter inkubering, samle dekselet glir og tøm av overflødig primær antistoffløsning. Plasser dekselet tilbake i 24-brønnplaten med cellesiden opp og vask dem tre ganger med PBS. Etter siste vask, samle dekselet glir og tøm av overflødig PBS før du plasserer hvert deksel slip med cellesiden ned på en 50 mikroliter dråpe sekundært antistoff løsning.
Inkuber i et fuktet kammer i en time. Etter inkubering, tøm av overflødig sekundær antistoffoppløsning og vask dekselet tre ganger med 500 mikroliter PBS i 24-brønnplaten. Etter å ha tappet overflødig PBS, plasser hver dekselslip med cellesiden ned på en 50 mikroliter dråpe krokløsning fortynnet en til 4.000 i PBS i et fuktet kammer.
Inkuber i et fuktet kammer i fem minutter. Fjern deretter overflødig krokløsning og vask dekselslippene tre ganger med PBS og en gang med avionisert vann i en 24 brønnplate. Etter drenering av overflødig avionisert vann, plasser hvert deksel på en 10 til 20 mikroliter dråpe monteringsløsning oppdaget på et mikroskopglass for å unngå dannelse av luftbobler.
