Till att börja med, frö HEK293A celler på glanstäcksskivor placerade i en 24-brunnsplatta som innehåller högt glukos DMEM tills de blir 80% sammanflytande. Nästa dag svälte cellerna i två timmar i Earls balanserade saltlösning. Efter behandlingen, aspirera mediet och tillsätt 500 mikroliter eller 4% formaldehydlösning i PBS och inkubera i 20 minuter vid rumstemperatur för att fixera cellerna.
Efter fixering, byt ut formaldehydlösningen mot 500 mikroliter PBS. Släck sedan den fria aldehydgruppen genom att tillsätta 500 mikroliter 50 millimolär ammoniumkloridlösning i PBS i 10 minuter vid rumstemperatur. Byt ut ammoniumkloridlösningen mot 500 mikroliter av en 50 mikrogram per milliliter digitoninlösning i PBS i fem minuter för att permeabilisera cellerna.
Efter permeabilisering, byt ut digitoninlösningen mot 500 mikroliter PBS som upprepar PBS-tvätt tre gånger. Efter den sista tvätten, inkubera cellerna i 500 mikroliter blockeringslösning i 30 minuter vid rumstemperatur. Efter inkubation, byt ut blockeringslösningen mot 500 mikroliter PBS.
Använd sedan en pincett, samla upp täckglasen från brunnen och ta bort överflödig PBS med tunna våtservetter. I den fuktade kammaren, lägg försiktigt ner täckglaset med cellsidan nedåt på en 50 mikroliter droppe primär antikroppslösning. Inkubera cellerna i en fuktad kammare i en timme i rumstemperatur.
Efter inkubationen samlas täckglasen upp och överflödig primär antikroppslösning dräneras. Sätt tillbaka täckglasen i 24-hålsplattan med cellsidan uppåt och tvätta dem tre gånger med PBS. Efter den sista tvätten, samla upp täckglasen och dränera bort överflödig PBS innan du placerar varje täckglas med cellsidan nedåt på en 50 mikroliter droppe sekundär antikroppslösning.
Inkubera i en fuktad kammare i en timme. Efter inkubationen töms överskottet av den sekundära antikroppslösningen och täckglaset tvättas tre gånger med 500 mikroliter PBS i 24-hålsplattan. Efter att ha tömt överflödig PBS, placera varje täckglas med cellsidan nedåt på en 50 mikroliter droppe kroklösning utspädd en till 4 000 i PBS i en fuktad kammare.
Inkubera i en fuktad kammare i fem minuter. Ta sedan bort överflödig kroklösning och tvätta täckglasen tre gånger med PBS och en gång med avjoniserat vatten i en 24-hålsplatta. Efter att ha tömt överflödigt avjoniserat vatten, placera varje täckglas på en 10 till 20 mikroliter droppe monteringslösning som fläckas på ett mikroskopglas för att undvika att luftbubblor bildas.
