لتصوير الخلايا الحية لتركيبات ATG9A ، HEK293A البذور الخلايا في ملليلتر من DMEM عالي الجلوكوز في طبق زراعة الأنسجة 60 ملم حتى تصل إلى التقاء 65 إلى 70٪. في اليوم التالي ، قم بإعداد وإضافة خليط الحمض النووي ليبوفيكتامين إلى لوحة زراعة الخلايا التي تحتوي على أربعة ملليلتر من وسط النمو وهز اللوحة برفق ذهابا وإيابا لتوزيع المزيج بالتساوي. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية و 10٪ ثاني أكسيد الكربون.
بعد أربع ساعات من النقل ، استبدل وسط النمو بوسط جديد واحتضن الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 10٪ ثاني أكسيد الكربون. في اليوم التالي ، التربسين الخلايا عن طريق إضافة التربسين EDTA. بعد ذلك ، عد الخلايا المنفصلة وأعد زرعها على طبق استزراع مناسب للفحص المجهري الحي طوال الليل.
في اليوم التالي ، قم بتصوير الخلايا باستخدام مجهر متحد البؤر. في الظروف القاعدية ، يتم توطين ATG9A بشكل أساسي في شبكة Golgi كما يتضح من التألق المناعي للبروتين الداخلي ويتداخل مع GM130 ، وهي علامة رابطة الدول المستقلة-جولجي. كانت eGFP N-taged ATG9A والموسومة ب mRFP N الموسومة طرفيا ATG9A أقل محلية في Golgi وتقيم بشكل أساسي في الحويصلات.
في المقابل ، يكون eGFPc ذو العلامات النهائية ATG9A أكثر عرضة للتجميع داخل الخلية. ساعد دمج تسلسل 3x-FLAG بين الفلوروفور N-terminal و ATG9A البروتين المفرط التعبير على التصرف بشكل مشابه للبروتين الداخلي. يتزامن mCherry 3x-FLAG ATG9A المعبر عنه بشكل مفرط مع علامة Golgi GM130 في ظروف التغذية.
تم الحفاظ على هذا التوطين والمقصورة الحويصلية AG9A بمرور الوقت ، مما سمح بالدراسة الزمانية المكانية للاتجار ب ATG9A.
