Live Cell Imaging of ATG9A Constructs

对于 ATG9A 构建体的活细胞成像，将 HEK293A 细胞接种在 2 毫升高葡萄糖 DMEM 中，放入 60 毫米组织培养皿中，直至它们达到 65% 至 70% 汇合度。第二天，准备lipofectamine DNA混合物并将其添加到含有4毫升生长培养基的细胞培养板中，并轻轻来回摇动板以均匀分布混合物。将细胞在 37 摄氏度和 10% 二氧化碳下孵育。

转染 4 小时后，用新鲜培养基替换生长培养基，并将细胞在 37 摄氏度下用 10% 二氧化碳孵育过夜。第二天，通过加入胰蛋白酶EDTA使细胞胰蛋白酶化。然后，对分离的细胞进行计数，并将它们重新接种在适合活体显微镜的培养皿上过夜。

第二天，使用共聚焦显微镜对细胞进行成像。在基础条件下，ATG9A主要定位于高尔基体网络，如内源性蛋白的免疫荧光所示，并与顺式高尔基体标志物GM130重叠。eGFP N端标记的ATG9A和mRFP N端标记的ATG9A在高尔基体的定位较少，主要驻留在囊泡中。

相比之下，eGFPc末端标记的ATG9A更容易在细胞内聚集。融合 N 端荧光基团和 ATG9A 之间的 3x-FLAG 序列有助于过表达蛋白的行为与内源性蛋白相似。在进料条件下，过表达的 mCherry 3x-FLAG ATG9A 与高尔基体标记物 GM130 共定位。

随着时间的流逝，这种定位和AG9A囊泡室得以保留，从而可以对ATG9A的运输进行时空研究。