Til levende cellebilleddannelse af ATG9A-konstruktioner frø HEK293A celler i to milliliter DMEM med høj glukose i en 60 millimeter vævskulturskål, indtil de når 65 til 70% sammenløb. Den næste dag skal du forberede og tilsætte lipofectamin-DNA-blandingen til cellekulturpladen, der indeholder fire ml vækstmedium, og forsigtigt vippe pladen frem og tilbage for at fordele blandingen jævnt. Inkuber cellerne ved 37 grader Celsius og 10% kuldioxid.
Efter fire timers transfektion udskiftes vækstmediet med et frisk medium og inkuberer cellerne natten over ved 37 grader Celsius med 10% kuldioxid. Den næste dag trypsiniserer cellerne ved at tilføje trypsin EDTA. Tæl derefter de løsrevne celler og frø dem igen på en kulturskål, der er egnet til levende mikroskopi natten over.
Den næste dag skal du afbilde cellerne ved hjælp af et konfokalmikroskop. Under basale forhold er ATG9A hovedsageligt lokaliseret ved Golgi-netværket som angivet ved immunofluorescensen af det endogene protein og overlapper med GM130, en cis-Golgi-markør. eGFP N-terminalt mærket ATG9A og mRFP N-terminalt mærket ATG9A var mindre lokaliseret ved Golgi og boede primært i vesikler.
I modsætning hertil er eGFPc terminalt mærket ATG9A mere tilbøjelig til at aggregere i cellen. Fusion af en 3x-FLAG-sekvens mellem en N-terminal fluorofor og ATG9A hjalp det overudtrykte protein med at opføre sig på samme måde som det endogene. Den overudtrykte mCherry 3x-FLAG ATG9A colokaliserer med Golgi-markøren GM130 under fodrede forhold.
Denne lokalisering og AG9A vesikulære rum blev bevaret over tid, hvilket muliggjorde den rumlige tidsmæssige undersøgelse af handel med ATG9A.