Voor beeldvorming van levende cellen van ATG9A-constructen, zaad HEK293A cellen in twee milliliter DMEM met een hoog glucosegehalte in een weefselkweekschaal van 60 millimeter totdat ze 65 tot 70% confluentie bereiken. Bereid de volgende dag het lipofectamine-DNA-mengsel voor en voeg het toe aan de celkweekplaat met vier milliliter groeimedium en schud de plaat voorzichtig heen en weer om het mengsel gelijkmatig te verdelen. Incubeer de cellen bij 37 graden Celsius en 10% koolstofdioxide.
Vervang na vier uur transfectie het groeimedium door een vers medium en incubeer de cellen 's nachts bij 37 graden Celsius met 10% koolstofdioxide. Probeer de volgende dag de cellen te trypsiniseren door trypsine EDTA toe te voegen. Tel vervolgens de losgemaakte cellen en zaai ze 's nachts opnieuw in op een kweekschaal die geschikt is voor levende microscopie.
Breng de volgende dag de cellen in beeld met een confocale microscoop. In basale omstandigheden is ATG9A voornamelijk gelokaliseerd in het Golgi-netwerk, zoals aangegeven door de immunofluorescentie van het endogene eiwit, en overlapt het met GM130, een cis-Golgi-marker. eGFP N-terminaal gelabeld ATG9A en mRFP N-terminaal gelabeld ATG9A waren minder gelokaliseerd op de Golgi en bevonden zich voornamelijk in blaasjes.
Daarentegen is eGFPc terminaal gelabeld ATG9A meer vatbaar voor aggregatie in de cel. Het samensmelten van een 3x-FLAG-sequentie tussen een N-terminale fluorofoor en ATG9A hielp het tot overexpressie gebrachte eiwit zich op dezelfde manier te gedragen als het endogene. De tot overexpressie gebrachte mCherry 3x-FLAG ATG9A colokaliseert met de Golgi-marker GM130 in gevoede omstandigheden.
Deze lokalisatie en het AG9A vesiculaire compartiment werden in de loop van de tijd bewaard, waardoor de spatiotemporele studie van de handel in ATG9A mogelijk werd.