Pour l’imagerie de cellules vivantes des constructions ATG9A, semez des cellules HEK293A dans deux millilitres de DMEM à haute teneur en glucose dans une boîte de culture tissulaire de 60 millimètres jusqu’à ce qu’elles atteignent une confluence de 65 à 70 %. Le lendemain, préparez et ajoutez le mélange d’ADN lipofectamine à la plaque de culture cellulaire contenant quatre millilitres de milieu de culture et balancez doucement la plaque d’avant en arrière pour répartir uniformément le mélange. Incuber les cellules à 37 degrés Celsius et 10% de dioxyde de carbone.
Après quatre heures de transfection, remplacez le milieu de culture par un milieu frais et incubez les cellules pendant la nuit à 37 degrés Celsius avec 10% de dioxyde de carbone. Le lendemain, trypsiniser les cellules en ajoutant de la trypsine EDTA. Ensuite, comptez les cellules détachées et réensemencez-les sur une boîte de culture adaptée à la microscopie vivante pendant la nuit.
Le lendemain, imagez les cellules à l’aide d’un microscope confocal. Dans les conditions basales, l’ATG9A est principalement localisé au niveau du réseau de Golgi comme l’indique l’immunofluorescence de la protéine endogène et se chevauche avec GM130, un marqueur cis-Golgi. ATG9A marqué par l’eGFP N-terminally et l’ATG9A mRFP N-terminally marqués étaient moins localisés au Golgi et résidaient principalement dans les vésicules.
En revanche, l’ATG9A marqué par eGFPc est plus susceptible de s’agréger à l’intérieur de la cellule. La fusion d’une séquence 3x-FLAG entre un fluorophore N-terminal et ATG9A a permis à la protéine surexprimée de se comporter de la même manière que la protéine endogène. Le mCherry 3x-FLAG ATG9A surexprimé colocalise avec le marqueur Golgi GM130 dans des conditions d’alimentation.
Cette localisation et le compartiment vésiculaire de l’AG9A ont été préservés dans le temps, permettant l’étude spatio-temporelle du trafic d’ATG9A.
