ATG9Aコンストラクトの生細胞イメージングでは、HEK293A細胞を2ミリリットルの高グルコースDMEMで60ミリメートルの組織培養皿に65〜70%のコンフルエントに達するまで播種します。翌日、リポフェクタミンDNA混合物を調製して、4ミリリットルの増殖培地を含む細胞培養プレートに加え、プレートを前後に静かに揺らして混合物を均一に分散させます。細胞を摂氏37度、二酸化炭素10%でインキュベートします。
4時間のトランスフェクション後、増殖培地を新しい培地と交換し、細胞を10%二酸化炭素で摂氏37度で一晩インキュベートします。翌日、トリプシンEDTAを添加して細胞をトリプシン化します。次に、剥離した細胞を数え、ライブ顕微鏡に適した培養皿に一晩再播種します。
翌日、共焦点顕微鏡を使用して細胞を画像化します。基底状態では、ATG9Aは内因性タンパク質の免疫蛍光によって示されるように、主にゴルジネットワークに局在し、シスゴルジマーカーであるGM130と重複しています。eGFP N末端タグ付きATG9AおよびmRFP N末端タグ付きATG9Aは、ゴルジ体にあまり局在しておらず、主に小胞に存在していた。
対照的に、末端でタグ付けされたATG9AのeGFPcは、細胞内で凝集しやすい傾向があります。N末端蛍光色素とATG9Aの間で3x-FLAG配列を融合させることで、過剰発現タンパク質は内因性タンパク質と同様に振る舞うようになりました。過剰発現したmCherry 3x-FLAG ATG9Aは、摂食条件下でゴルジマーカーGM130と共局在します。
この局在とAG9A小胞コンパートメントは長期にわたって保存され、ATG9Aの輸送の時空間的研究が可能になりました。