For levende celleavbildning av ATG9A-konstruksjoner, frø HEK293A celler i to milliliter høyglukose DMEM i en 60 millimeter vevskulturskål til de når 65 til 70% sammenløp. Neste dag, klargjør og tilsett lipofectamine DNA-blandingen til cellekulturplaten som inneholder fire milliliter vekstmedium og forsiktig rocke platen frem og tilbake for å fordele blandingen jevnt. Inkuber cellene ved 37 grader Celsius og 10% karbondioksid.
Etter fire timers transfeksjon, erstatt vekstmediet med et friskt medium og inkuber cellene over natten ved 37 grader Celsius med 10% karbondioksid. Neste dag, trypsiniser cellene ved å legge til trypsin EDTA. Deretter teller du de frittliggende cellene og frø dem på nytt på en kulturskål som er egnet for levende mikroskopi over natten.
Neste dag, bilde cellene ved hjelp av et konfokalmikroskop. I basale forhold er ATG9A hovedsakelig lokalisert i Golgi-nettverket som indikert ved immunfluorescens av det endogene proteinet og overlapper med GM130, en cis-Golgi-markør. eGFP N-terminalt merket ATG9A og mRFP N-terminalt merket ATG9A var mindre lokalisert på Golgi og bodde primært i vesikler.
I motsetning til dette er eGFPc terminalt merket ATG9A mer tilbøyelig til å aggregere i cellen. Fusjon av en 3x-FLAG-sekvens mellom en N-terminal fluorofor og ATG9A hjalp det overuttrykte proteinet til å oppføre seg på samme måte som det endogene. Den overuttrykte mCherry 3x-FLAG ATG9A samlokaliserer med Golgi-markøren GM130 under matede forhold.
Denne lokaliseringen og AG9A vesikulært rom ble bevart over tid, noe som muliggjorde den spatiotemporale studien av handel med ATG9A.