För avbildning av levande celler av ATG9A-konstruktioner, frö HEK293A celler i två milliliter DMEM med hög glukoshalt i en 60-millimeters vävnadsodlingsskål tills de når 65 till 70 % sammanflöde. Nästa dag, förbered och tillsätt lipofectamine DNA-blandningen till cellodlingsplattan som innehåller fyra milliliter tillväxtmedium och gunga försiktigt plattan fram och tillbaka för att fördela blandningen jämnt. Inkubera cellerna vid 37 grader Celsius och 10% koldioxid.
Efter fyra timmars transfektion, byt ut odlingsmediet mot ett nytt medium och inkubera cellerna över natten vid 37 grader Celsius med 10 % koldioxid. Nästa dag trypsiniserar du cellerna genom att tillsätta trypsin EDTA. Räkna sedan de lossnade cellerna och plantera om dem på en odlingsskål som är lämplig för levande mikroskopi över natten.
Nästa dag avbildar du cellerna med ett konfokalmikroskop. Under basala förhållanden är ATG9A huvudsakligen lokaliserad vid Golgi-nätverket, vilket indikeras av immunofluorescensen hos det endogena proteinet och överlappar med GM130, en cis-Golgi-markör. eGFP N-terminalt taggade ATG9A och mRFP N-terminalt märkta ATG9A var mindre lokaliserade vid Golgi och fanns främst i vesiklar.
Däremot är eGFPc terminalmärkt ATG9A mer benägen att aggregera i cellen. Sammansmältning av en 3x-FLAG-sekvens mellan en N-terminal fluorofor och ATG9A hjälpte det överuttryckta proteinet att bete sig på samma sätt som det endogena. Den överuttryckta mCherry 3x-FLAG ATG9A samlokaliseras med Golgi-markören GM130 under utfodrade förhållanden.
Denna lokalisering och AG9A-vesikulärfacket bevarades över tid, vilket möjliggjorde en spatiotemporal studie av handeln med ATG9A.