Begynn med å aspirere media fra platene som inneholder adherent rå 264.7. Tilsett 10 ml PBS per 15 centimeter plate. Bruk en celleskraper til å løsne cellene og trekke dem inn i et enkelt 50 milliliter rør.
Pipett cellesuspensjonen opp og ned for å homogenisere. Deretter overfører du 5% av celleopphengsvolumet til et nytt 1,5 milliliter rør. Sentrifuge ved 300G i fem minutter ved romtemperatur.
Kast supernatanten og legg den totale cellefraksjonen på is. Etter sentrifugering av den gjenværende suspensjonen som beskrevet tidligere, aspirer supernatanten og suspender cellepelleten på nytt i fem milliliter iskald mitokondriebuffer. Sentrifuger suspensjonen ved 300G i fem minutter ved fire grader Celsius.
Suspender pelleten på nytt i 0,5 ml kald mitokondriell buffer. Og overfør suspensjonen til et 1,5 milliliter rør. Deretter homogeniserer du suspensjonen, omgår den 30 ganger gjennom en 25 gauge nål montert på en milliliter sprøyte.
Deretter tilsettes en milliliter kald mitokondriebuffer til røret og blandes ved inversjon. Etter sentrifugering av cellene, overfør en milliliter av supernatanten til et nytt rør på is. Suspender pelleten på nytt i bufferen og homogeniser pelleten ved å føre gjennom en 25 gauge nål montert på en milliliter sprøyte.
Trekk de homogeniserte cellepellets og supernatanten fra de forrige trinnene inn i et enkelt 1,5 milliliter rør. Sentrifuger den ved 2.000 G i fem minutter ved fire grader Celsius. Samle supernatanten og del den i fire 1,5 milliliter rør.
Øk volumet i hvert rør til 1,5 milliliter ved hjelp av mitokondriell buffer. Inverter rørene for å blande innholdet og sentrifuge rørene. Fjern forsiktig supernatanten og den øvre hvite cellepelleten.
Hold en av de fire rørene som inneholder den brune mitokondrielle pelleten på is som en rå mitokondriell fraksjon. Trekk de resterende pellets inn i et nytt rør og gjør det endelige volumet en milliliter med mitokondriebuffer. Ved hjelp av denne protokollen ble totale celler og rå mitokondriefraksjoner oppnådd fra den rå 264,7 makrofagcellelinjen og BMDM.
Immunblodanalyse viste at mitokondriesitratsyntasen var anriket i den rå fraksjonen. Proteiner fra cytosol, plasmamembran, kjerne, lysosom og endoplasmatisk retikulum forsvant. Proteomanalyse viste en anrikning på mer enn ti ganger i råfraksjonen.
De andre seks cellulære rommene ble tømt under rensing.
