Begin met het overbrengen van een milliliter ruwe fractie van RAW 264,7 mitochondriën in een conische buis van 15 milliliter. Voeg 7 milliliter gezouten mitochondriale buffer toe, aangevuld met 150 millimolair natriumchloride. Voeg aan de ophanging 50 microliter TOM22-kralen toe en incuber de buis vervolgens op een roterend wiel bij lage snelheid.
Plaats een kolom op de magneet en breng de kolom in evenwicht met acht milliliter gezouten mitochondriale buffer. Gooi de doorstroming weg. Breng het na de incubatie van het monster over naar de kolom en gooi de doorstroming weg.
Was vervolgens de kolom drie keer met acht milliliter gezouten mitochondriale buffer. Verwijder de kolom van de magneet en plaats deze in een conische buis van 15 milliliter. Om de mitochondriën te elueren, voegt u 1,5 milliliter gezouten mitochondriale buffer toe en brengt u onmiddellijk een zuiger aan om de gezuiverde fractie in de buis te elueren.
Breng de geëlueerde fractie over naar een nieuwe buis van 1,5 milliliter en voer centrifugatie uit bij 21.000 G gedurende 10 minuten bij 4 graden Celsius. Gooi het gevormde supernatant weg en bewaar de bruine zuivere mitochondriale pellet bij 20 graden Celsius voor toekomstig onderzoek. Immunoblot-analyse van de gezuiverde mitochondriale extracten toonde verrijking van mitochondriaal citraatsynthase en uitputting van eiwitten uit andere celorganellen.
Mitochondriale integriteitsstudies met behulp van elektronenmicroscopie onthulden mitochondriën met een klassieke ovale vorm en intacte cristae omringd door elektrondichte antilichaam-gecoate kralen. Verder toonde proteoomanalyse verrijking van mitochondriale eiwitten en twee verschillende populaties die overeenkomen met mitochondriale en niet-mitochondriale eiwitten.
