RAW 264.7 미토콘드리아의 1밀리리터 조율을 15밀리리터 원뿔형 튜브에 옮기는 것으로 시작합니다. 150 밀리몰 염화나트륨으로 보충 된 소금에 절인 미토콘드리아 완충액 7 밀리리터를 첨가하십시오. 현탁액에 50마이크로리터의 TOM22 비드를 추가한 다음 회전하는 휠에서 튜브를 저속으로 배양합니다.
자석에 컬럼을 놓고 8밀리리터의 염장된 미토콘드리아 완충액으로 컬럼을 평형화합니다. 플로우 스루를 폐기하십시오. 샘플 인큐베이션 후 컬럼으로 옮기고 플로우 스루를 버립니다.
다음으로, 8 밀리리터의 염염 미토콘드리아 완충액으로 컬럼을 3 회 세척한다. 자석에서 컬럼을 제거하고 15밀리리터 원뿔형 튜브에 넣습니다. 미토콘드리아를 용출하려면 1.5 밀리리터의 소금에 절인 미토콘드리아 완충액을 첨가하고 즉시 플런저를 적용하여 정제 된 분획을 튜브에 용출시킵니다.
용출된 분획을 새로운 1.5밀리리터 튜브로 옮기고 섭씨 4도에서 10분 동안 21, 000G에서 원심분리를 수행합니다. 형성된 상층액을 버리고 향후 연구를 위해 갈색 순수 미토콘드리아 펠릿을 섭씨 20도에 보관합니다. 정제된 미토콘드리아 추출물의 면역블롯 분석은 미토콘드리아 구연산염 합성효소의 농축 및 다른 세포 소기관의 단백질 고갈을 보여주었습니다.
전자 현미경을 사용한 미토콘드리아 무결성 연구는 고전적인 타원형과 전자 밀도가 높은 항체 코팅 비드로 둘러싸인 온전한 크리스타를 가진 미토콘드리아를 밝혀냈습니다. 또한, 프로테옴 분석은 미토콘드리아 단백질과 미토콘드리아 및 비미토콘드리아 단백질에 해당하는 두 개의 별개의 집단의 농축을 보여주었습니다.
