Name: Immunostaining of Mouse Stria Vascularis and Tissue Mounting
Uploaded: 2023-04-21T12:50:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining of Mouse Stria Vascularis and Tissue Mounting at JoVE.com

immunostaining of mouse stria vascularis and tissue mounting

Tek Çekirdekli Dizileme veya İmmün Boyama için Stria Vascularis Mikrodiseksiyonu

The cochlea consists of three fluid filled chambers, the scala vestibuli, scala media, and scala tympani. The scala vestibuli and scala tympani each contain perilymph, which has a high concentration of sodium (138 mM) and a low concentration of potassium (6.8 mM)1. The scala media contains endolymph, which has a high concentration of potassium (154 mM) and a low concentration of sodium (0.91 mM)1,2,3. This difference in ion concentration can be referred to as the endocochlear potential (EP), and is primarily generated by the movement of potassium ions through various ion channels and gap junctions in the stria vascularis (SV) along the lateral wall of the cochlea4,5,6,7,8,9,10,11. The SV is a heterogenous, highly vascularized tissue that lines the medial aspect of the lateral wall of the cochlea and contains three main cell types: marginal, intermediate, and basal cells12 (Figure 1).
Marginal cells are connected by tight junctions to form the most medial surface of the SV. The apical membrane faces the endolymph of the scala media and contributes to potassium ion transport into the endolymph using various channels, including KCNE1/KCNQ1, SLC12A2, and Na+-K+-ATPase (NKA)5,10,13,14. Intermediate cells are pigmented cells that reside between marginal and basal cells and facilitate potassium transport through the SV using KCNJ10 (Kir 4.1)15,16. Basal cells lie in close proximity to the lateral wall of the cochlea and are closely associated with fibrocytes of the spiral ligament to promote potassium recycling from the perilymph12. Pathology of the SV has been implicated in numerous otologic disorders17,18. Mutations in genes expressed in the major SV cell types, such as Kcnq1, Kcne1, Kcnj10, and Cldn11, can cause deafness and SV dysfunction, including the loss of EP19,20,21,22,23. In addition to the three major cell types, there are other less-studied cell types in the SV, such as spindle cells22, root cells12,24, macrophages25, pericytes26, and endothelial cells27, that have incompletely defined roles involving ionic homeostasis and the generation of EP28.
In comparison to bulk RNA-sequencing, single-nuclei RNA-sequencing (sNuc-Seq) provides information about cell heterogeneity, rather than an average of mRNA across a group of cells29, and can be particularly useful when studying the heterogenous SV30. For example, sNuc-Seq has produced transcriptional analysis that suggests there may be a role for spindle and root cells in EP generation, hearing loss, and Meniere&#39;s disease18. Further transcriptional characterization of the various SV cell types can provide us with invaluable information on the pathophysiology underlying different mechanisms and subtypes of SV-related hearing fluctuation and hearing loss. The harvest of these delicate inner ear structures is of paramount importance to optimal tissue analysis.
In this study, the microdissection approach to access and isolate the stria vascularis from the adult mouse cochlea for sNuc-Seq or immunostaining is described. Dissection of the adult mouse SV is required to understand various SV cell types and further characterize their role in hearing.

Yazar Spot Işığı: Tek Çekirdekli Dizileme veya İmmün Boyama için Yetişkin Fare Stria Vascularis'in Diseksiyonu  

Tek çekirdekli dizileme veya immün boyama için yetişkin fare stria vascularis'in diseksiyonu

The stria vascularis functions to generate the endocochlear potential and regulate ion homeostasis in the cochlea. The auditory development and restoration program seeks to understand the underlying mechanisms connecting dysfunctional ion homeostasis with hearing and stability disorders, which are diseases where either fluctuation in or sudden hearing loss occurs. Work in my lab has established the transcriptional landscape of the stria vascularis and has contributed to our understanding of its importance in hearing.We have used these data to draw parallels to poorly-understood hearing and stability disorders, including Meniere's disease. This protocol enables the dissection and isolation of whole-mount stria vascularis for further molecular studies including immunohistochemistry. Given that stria vascularis cell types are intricately intertwined with one another, the use of nuclear isolation and single-nucleus RNA sequencing has facilitated our understanding of the distinct transcriptional machinery involved.

Watch this Scientific Journal Video about Immunostaining of Mouse Stria Vascularis and Tissue Mounting at JoVE.com

Immunostaining of Mouse Stria Vascularis and Tissue Mounting  

Fare stria vaskülaris immünoboyama ve doku montajı

Stria vascularis'i fareden diseke ederek immün boyamaya hazırlanın ve dokuyu 1X PBS'de 200 mikrolitre% 4 paraformaldehit içeren 24 delikli bir plakaya ekleyin. Dokuyu oda sıcaklığında 20 dakika boyunca inkübe edin. Düşük RPM'de bir yörüngesel çalkalayıcıda iki kısa 1X PBS yıkama gerçekleştirin.PBS'yi çıkarın, ardından 300 mikrolitre PBST çözeltisinde oda sıcaklığında en az bir saat boyunca geçirgenlik ve blokaj yapın. Daha sonra, dokuyu bir gecede dört santigrat derecede birincil antikorla boyayın. Daha sonra ikincil bir antikor ekleyin ve düşük RPM'de bir orbital çalkalayıcı üzerinde oda sıcaklığında iki saat boyunca inkübe edin.Floresan etiketli ikincil antikoru ışıktan korumak için plakayı örtün. Daha sonra, 25 mm eksen boyunca, 18 x 18 milimetrelik cam kapak kaymasından sadece daha küçük iki küçük yapıştırıcı çizgisi yerleştirerek daha büyük bir mikro slayt hazırlayın. Tutkal çizgileri arasına bir damla montaj reaktifi yerleştirin.55 numaralı forseps kullanarak, SV'nin bir ucunda mümkün olduğunca az doku toplayın ve PBS'den montaj reaktifine aktarın. Kapak kaymasının bir ucunu, bir yapıştırıcı çizgisinin yerleştirildiği slayta yerleştirin. Ardından, hava kabarcıkları oluşturmamak için kapak kayışını yavaşça serbest bırakın.Montajın her köşesine bir damla şeffaf oje sürerek montajı kapatın. Numuneyi cam kapak kayması üzerinde, görselleştirme alanından uzakta etiketleyin. SV dokusunu diseksiyon mikroskobu altında görselleştirerek düz bir şekilde yattığından ve herhangi bir hava kabarcığının yakınında olmadığından emin olun.SV dokusu doğru yönlendirilmemişse, hava kabarcıklarını dışarı itmeye çalışın veya daha küçük cam kapak kaymasını dikkatlice çıkarın ve SV'yi yeniden konumlandırın. P30 fareden bütün bir SV montajı hazırlandı ve konfokal görüntüleme yapıldı. Ara hücrelerde ZsGreen ekspresyonu gözlendi, GSIB4 etiketli endotel hücreleri ve DAPI çekirdekleri etiketledi.