Börja med att placera vävnaden i en steril vävnadsodlingsplatta och ta bort överflödigt media. Mät vävnaden med en steril metalllinjal och fotografera den. Tillsätt tre milliliter avancerat DMEM/F-12-media till den skurna vävnaden och pipettera vävnaden upp och ner för att tvätta den.
Tvätta sedan vävnaden med tre milliliter PBS. Sug upp mediet från vävnadsodlingsplattan och skär det i små bitar med hjälp av sterila blad och två milliliter matsmältningsmedium. Samla sedan vävnaden i ett 50-milliliters rör som innehåller totalt fem milliliter av matsmältningsmediet.
Inkubera röret vid 37 grader Celsius i en timme. Blanda suspensionen med jämna mellanrum genom att pipettera upp och ner. Inaktiverar trypsinet genom att tillsätta fem milliliter avancerad DMEM/F-12 till röret.
Filtrera sedan provet genom en 70 mikrometer porsil för att ta bort eventuellt stort skräp. Pipettera nu två milliliter DMEM som innehåller 10%FBS till toppen av filtret och använd en pipett för att samla upp skräp och vävnadsrester för fibroblastodling. Plätera sedan skräpet för fibroblastodling.
Centrifugera filtratet vid rumstemperatur vid 200 till 300 G i fem minuter och aspirera sedan supernatanten. Tillsätt fem milliliter avancerad DMF 12 till pelleten och centrifugera suspensionen igen vid 300 G i fem minuter. För lys av röda blodkroppar, återsuspendera pelleten i fyra milliliter ammoniumkloridkaliumlysbuffert och överför den till ett 15-milliliters rör.
Inkubera cellerna i rumstemperatur i två minuter. Efter centrifugering av blandningen under samma förhållanden som tidigare visats, aspirera supernatanten. Tillsätt fem milliliter avancerad DMEM/F-12 till pelleten och centrifugera igen vid fyra grader Celsius.
Efter aspirering av supernatanten, tillsätt en milliliter kommersiellt tillgängligt celldissociationsreagens till pelleten och inkubera den i två till tre minuter vid rumstemperatur. Efter inkubationen centrifugeras supernatanten och aspireras igen. Återsuspendera sedan pelleten i fem milliliter avancerad DMEM/F-12.
Dissociera cellklumpar genom att pipettera suspensionen flera gånger med en P1000-pipett. Centrifugera suspensionen och avlägsna supernatanten. Skaffa sedan förkylda P1000- och P200-pipettspetsar och använd de kalla spetsarna som är fästa på P1000-pipetten för att återsuspendera cellpelleten i membranmatrisen innan du placerar Falcon på is för att förhindra stelning.
Ta ut den förvärmda plattan från inkubatorn. Använd pipetten P200 inställd på 48 mikroliter och använd kalla spetsar för att skapa basalmembranmatriskupoler i den förvärmda plattan. Inkubera den sedan för att stelna basalmembranblandningen.
När matrisen har stelnat, tillsätt två till två och en halv milliliter avancerad DMEM/F-12, kompletterad med tillväxtfaktorer och hämmare. Tumörceller isolerades och tumörorganoider etablerades från färsk vävnad under en 15-dagarsperiod. Ibland förhindrar stora cellrester en korrekt visualisering av tumörorganoider som håller på att utvecklas.
Utvecklande organoider observerades att fenotypiskt varierar från isolerade, rundade till sfäroida eller aggregatliknande kulturer, beroende på tumörens ursprung. Organoidkulturer kan vara kontaminerade av fibroblaster, en vanlig PI-produkt från primär tumörcellodling. Efter cirka sju dagars odling migrerar fibroblasterna från basalmembranmatriskupolerna och fäster vid cellplattorna, vilket kan äventyra optimal organoidtillväxt.
Fibroblastkulturer etableras från vävnadsresterna som återvunnits från filtret. Cellerna vandrar ut ur vävnadsresterna och fäster vid odlingsplattorna.