لبدء النشاف الغربي لعينات الحمض النووي المهضومة الطبيعية ، أضف 4X Laemmli عينة عازلة وقم بغلي العينة لمدة خمس دقائق. قم بتحميل خمسة إلى ستة ميكروجرامات من العينة المهضومة على 4 إلى 20٪ من هلام بولي أكريلاميد وقم بإجراء SDS-PAGE لحل التعديلات غير المعدلة وما بعد الترجمة أو DPCs المترافقة PMT. احتضان الجل مع بقعة كوماسي الزرقاء بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
اغسل الجل بالماء المقطر المزدوج لمدة ساعتين قبل الحصول على الصورة. للكشف عن الوجود في كل مكان ، SUMO-1 أو SUMO-2 و 3 تعديل ، ريبوسيل ADP ، إجمالي TOP1 ، TOP2 alpha ، أو TOP2 beta DPCs ، قم بتخفيف الأجسام المضادة المقابلة كما هو موضح في الجدول. بعد ذلك ، انقل الجل في تخفيف مناسب للجسم المضاد الأولي في منع المخزن المؤقت واحتضان الأغشية طوال الليل عند أربع درجات مئوية.
بمجرد الانتهاء من ذلك ، احتضان غشاء مغسول PBST بجسم مضاد ثانوي مخفف 5،000 أضعاف في المخزن المؤقت المانع لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة قبل تطوير الغشاء بكاشف تلألؤ كيميائي محسن. الحصول على صورة باستخدام نظام التصوير. أدى التعرض للكامبتوثيسين إلى تكوين TOP1 DPCs.
بلغ تشكيل TOP1 DPCs ذروته بعد 20 دقيقة من التعرض للكامبتوثيسين على غرار التعديل المضاد ل SUMO-2 و 3. كما لوحظ تتويج تعديل SUMO-1 وانتشاره في كل مكان. تضاءلت DPCs وتعديلات SUMO-2 و 3 TOP1 الخاصة بها بطريقة تعتمد على جرعة الكامبتوثيسين.
وصلت TOP2 DPCs التي تسببها الخلايا الشحمية وتعديل SUMO-2 و 3 إلى ذروتها في 20 دقيقة ثم انخفضت. وبالمقارنة ، بلغت تعديلات SUMO-1 و ubiquitin ذروتها في 60 دقيقة. تشكلت DPCs التي يسببها الفورمالديهايد و SUMO-2 و 3 و SUMO-1 و ubiquitylation وتراكمت بطريقة تعتمد على الجرعة.
الكشف الكمي عن PARylation من TOP1 DPCs باستخدام جسم مضاد مضاد PAR ، TOP1 DPC لم يكن من الممكن اكتشاف PARylation ما لم تتم إضافة مثبط PARG إلى الخلية ، مما يشير إلى أن PARylation يحدث على الفور وديناميكي للغاية.