For at begynde den vestlige blotting af de normaliserede fordøjede DNA-prøver tilsættes 4X Laemmli prøvebuffer og koges prøven i fem minutter. Læg fem til seks mikrogram fordøjet prøve på 4 til 20% polyacrylamidgel, og udfør SDS-PAGE for at løse umodificerede og posttranslationelle modifikationer eller PMT-konjugerede DPC'er. Inkuber gelen med Coomassie-blå plet natten over ved stuetemperatur.
Vask gelen med dobbelt destilleret vand i to timer før billedoptagelse. For at detektere ubiquitylering, SUMO-1 eller SUMO-2 og 3 modifikation, ADP ribosylering, total TOP1, TOP2 alpha eller TOP2 beta DPC'er, fortyndes de tilsvarende antistoffer som vist i tabellen. Derefter overføres gelen i en passende fortynding af det primære antistof i blokerende buffer og inkuberes membranerne natten over ved fire grader Celsius.
Når det er gjort, inkuberes PBST-vasket membran med et sekundært antistof fortyndet 5.000 gange i blokerende buffer i 60 minutter ved stuetemperatur, inden membranen udvikles med forbedret kemiluminescensreagens. Få et billede ved hjælp af billedbehandlingssystemet. Camptothecin-eksponeringen inducerede TOP1 DPC'er dannelse.
TOP1 DPC-dannelsen toppede efter 20 minutters camptothecineksponering svarende til anti-SUMO-2- og 3-modifikationen. Kulminationen af SUMO-1-modifikation og ubiquitylering blev også observeret. DPC'er og deres SUMO-2 og 3 TOP1 modifikationer faldt på en camptothecin dosisafhængig måde.
Adipocyt-inducerede TOP2 DPC'er og SUMO-2 og 3 modifikation nåede til peak efter 20 minutter og faldt derefter. Til sammenligning toppede SUMO-1 og ubiquitin modifikationer efter 60 minutter. De formaldehydinducerede DPC'er og deres SUMO-2 og 3, SUMO-1 og ubiquitylering dannet og akkumuleret på en dosisafhængig måde.
Den kvantitative påvisning af PARylering af TOP1 DPC'er ved anvendelse af et anti-PAR-antistof, TOP1 DPC PARylering, kunne ikke påvises, medmindre en PARG-hæmmer blev tilsat cellen, hvilket tyder på, at PARylering viser sig straks og er meget dynamisk.
