Om te beginnen met het westelijke vlekken van de genormaliseerde verteerde DNA-monsters, voegt u 4X Laemmli-monsterbuffer toe en kookt u het monster gedurende vijf minuten. Laad vijf tot zes microgram verteerd monster op 4 tot 20% polyacrylamidegel en voer SDS-PAGE uit om ongewijzigde en posttranslationele modificaties of PMT-geconjugeerde DPC's op te lossen. Incubeer de gel met Coomassie blauwe vlek 's nachts bij kamertemperatuur.
Was de gel met dubbel gedestilleerd water gedurende twee uur voordat u het beeld verwerft. Om alomtegenwoordigheid, SUMO-1 of SUMO-2 en 3 modificatie, ADP ribosylatie, totale TOP1, TOP2 alfa of TOP2 bèta DPC's te detecteren, verdunt u de overeenkomstige antilichamen zoals weergegeven in de tabel. Breng vervolgens de gel over in een geschikte verdunning van het primaire antilichaam in de blokkerende buffer en incuber de membranen 's nachts bij vier graden Celsius.
Eenmaal klaar, incubeer PBST gewassen membraan met een secundair antilichaam verdund 5.000 keer in blokkerende buffer gedurende 60 minuten bij kamertemperatuur voordat het membraan wordt ontwikkeld met verbeterd chemiluminescentiereagens. Verkrijg een beeld met behulp van het beeldvormingssysteem. De camptothecine-blootstelling veroorzaakte de vorming van TOP1 DPC's.
De TOP1 DPC-formatie piekte na 20 minuten blootstelling aan camptothecine, vergelijkbaar met de anti-SUMO-2- en 3-modificatie. Het hoogtepunt van SUMO-1-modificatie en alomtegenwoordigheid werd ook waargenomen. DPC's en hun SUMO-2 en 3 TOP1 modificaties verminderden op een camptothecine dosisafhankelijke manier.
Adipocyten-geïnduceerde TOP2 DPC's en SUMO-2 en 3 modificatie bereikten een piek na 20 minuten en namen vervolgens af. Ter vergelijking: SUMO-1 en ubiquitinemodificaties piekten op 60 minuten. De formaldehyde-geïnduceerde DPC's en hun SUMO-2 en 3, SUMO-1 en ubiquitylatie vormden en accumuleerden op een dosisafhankelijke manier.
De kwantitatieve detectie van PARylatie van TOP1 DPC's met behulp van een anti-PAR-antilichaam, TOP1 DPC PARylation was niet detecteerbaar tenzij een PARG-remmer aan de cel werd toegevoegd, wat suggereert dat PARylation snel optreedt en zeer dynamisch is.