Pour commencer le transfert occidental des échantillons d’ADN digérés normalisés, ajoutez 4X tampon d’échantillon Laemmli et faites bouillir l’échantillon pendant cinq minutes. Chargez cinq à six microgrammes d’échantillon digéré sur un gel de polyacrylamide de 4 à 20 % et effectuez un SDS-PAGE pour résoudre les modifications non modifiées et post-traductionnelles ou les DPC conjugués PMT. Incuber le gel avec la coloration au bleu de Coomassie pendant la nuit à température ambiante.
Lavez le gel avec de l’eau distillée pendant deux heures avant l’acquisition de l’image. Pour détecter l’ubiquitylation, la modification de SUMO-1 ou SUMO-2 et 3, la ribosylation d’ADP, les DPC TOP1 totaux, TOP2 alpha ou TOP2 bêta, diluez les anticorps correspondants comme indiqué dans le tableau. Ensuite, transférez le gel dans une dilution appropriée de l’anticorps primaire dans un tampon bloquant et incubez les membranes pendant la nuit à quatre degrés Celsius.
Une fois cela fait, incuber la membrane lavée au PBST avec un anticorps secondaire dilué 5 000 fois dans un tampon bloquant pendant 60 minutes à température ambiante avant de développer la membrane avec un réactif de chimiluminescence amélioré. Acquérir une image à l’aide du système d’imagerie. L’exposition à la camptothécine a induit la formation de DPC TOP1.
La formation de DPC TOP1 a atteint un pic après 20 minutes d’exposition à la camptothécine similaire à la modification anti-SUMO-2 et 3. Le point culminant de la modification et de l’ubiquitylation de SUMO-1 a également été observé. Les DPC et leurs modifications SUMO-2 et 3 TOP1 ont diminué d’une manière dose-dépendante de la camptothécine.
Les DPC TOP2 induits par les adipocytes et la modification de SUMO-2 et 3 ont atteint un pic à 20 minutes, puis ont diminué. En comparaison, les modifications de SUMO-1 et d’ubiquitine ont culminé à 60 minutes. Les CPD induits par le formaldéhyde et leurs SUMO-2 et 3, SUMO-1 et ubiquitylation se sont formés et se sont accumulés de manière dose-dépendante.
La détection quantitative de la PARylation des DPC TOP1 à l’aide d’un anticorps anti-PAR, TOP1 DPC PARylation, n’était pas détectable à moins qu’un inhibiteur de PARG ne soit ajouté à la cellule, ce qui suggère que la PARylation se produit rapidement et est très dynamique.