標準化された消化DNAサンプルのウェスタンブロッティングを開始するには、4X Laemmliサンプルバッファーを添加し、サンプルを5分間煮沸します。5〜6マイクログラムの消化サンプルを4〜20%のポリアクリルアミドゲルにロードし、SDS-PAGEを実行して、未修飾および翻訳後修飾またはPMT共役DPCを分離します。 ゲルをクマシーブルーステインで室温で一晩インキュベートします。
画像取得の前に、ゲルを二重蒸留水で2時間洗浄します。ユビキチン化、SUMO-1またはSUMO-2および3修飾、ADPリボシル化、総TOP1、TOP2アルファ、またはTOP2ベータDPCを検出するには、表に示すように対応する抗体を希釈します。次に、ブロッキングバッファーで一次抗体を適切に希釈したゲルに移し、メンブレンを摂氏4度で一晩インキュベートします。
完了したら、PBST洗浄メンブレンをブロッキングバッファーで5, 000倍に希釈した二次抗体で室温で60分間インキュベートしてから、化学発光試薬を強化してメンブレンを開発します。イメージングシステムを使用して画像を取得します。カンプトテシン曝露はTOP1 DPCs形成を誘導した。
TOP1 DPCs形成は、抗SUMO-2および3修飾と同様に、カンプトテシン曝露の20分後にピークに達した。SUMO-1修飾とユビキチン化の集大成も観察された。DPCとそのSUMO-2および3 TOP1修飾は、カンプトテシン用量依存的に減少しました。
脂肪細胞誘導性TOP2 DPCおよびSUMO-2および3修飾は20分でピークに達し、その後減少した。比較すると、SUMO-1およびユビキチン修飾は60分でピークに達した。ホルムアルデヒド誘発性DPCとそのSUMO-2および3、SUMO-1、およびユビキチン化は用量依存的に形成および蓄積されました。
抗PAR抗体を用いたTOP1 DPCのPAR化の定量的検出では、PARG阻害剤を細胞に添加しないとTOP1 DPCのPAR化は検出できず、PAR化が速やかに発生し、非常に動的であることが示唆された。
