For å starte den vestlige blottingen av de normaliserte fordøyede DNA-prøvene, tilsett 4X Laemmli prøvebuffer og kok prøven i fem minutter. Legg fem til seks mikrogram fordøyd prøve på 4 til 20% polyakrylamidgel og utfør SDS-PAGE for å løse umodifiserte og posttranslasjonelle modifikasjoner eller PMT-konjugerte DPCer. Inkuber gelen med Coomassie blå flekk over natten ved romtemperatur.
Vask gelen med dobbelt destillert vann i to timer før bildeopptak. For å oppdage ubiquitylering, SUMO-1 eller SUMO-2 og 3 modifikasjon, ADP ribosylering, total TOP1, TOP2 alfa eller TOP2 beta DPCer, fortynn de tilsvarende antistoffene som vist i tabellen. Deretter overføres gelen i en passende fortynning av primærantistoff i blokkeringsbuffer og inkuberer membranene over natten ved fire grader Celsius.
Når det er gjort, inkuber PBST vasket membran med et sekundært antistoff fortynnet 5.000 ganger i blokkeringsbuffer i 60 minutter ved romtemperatur før du utvikler membranen med forbedret kjemiluminescensreagens. Skaff deg et bilde ved hjelp av bildesystemet. Camptothecineksponeringen induserte TOP1 DPCs-dannelse.
TOP1 DPCs-formasjonen toppet seg etter 20 minutters camptothecineksponering som ligner på anti-SUMO-2 og 3-modifikasjonen. Kulminasjonen av SUMO-1-modifikasjon og ubiquitylering ble også observert. DPC og deres SUMO-2 og 3 TOP1 modifikasjoner redusert på en camptothecin doseavhengig måte.
Adipocyttinduserte TOP2 DPCer og SUMO-2 og 3 modifikasjon nådde topp etter 20 minutter og ble deretter redusert. Til sammenligning toppet SUMO-1 og ubiquitin-modifikasjoner på 60 minutter. De formaldehydinduserte DPCene og deres SUMO-2 og 3, SUMO-1 og ubiquitylering dannet og akkumulert på en doseavhengig måte.
Den kvantitative påvisningen av PARylering av TOP1 DPCer ved bruk av et anti-PAR-antistoff, TOP1 DPC PARylering, var ikke detekterbar med mindre en PARG-hemmer ble lagt til cellen, noe som tyder på at PARylering skjer raskt og er svært dynamisk.