Para comenzar la transferencia occidental de las muestras de ADN digerido normalizadas, agregue 4X tampón de muestra Laemmli y hierva la muestra durante cinco minutos. Cargue de cinco a seis microgramos de muestra digerida en gel de poliacrilamida al 4 al 20% y realice SDS-PAGE para resolver modificaciones no modificadas y postraduccionales o CPD conjugados con PMT. Incubar el gel con tinción azul de Coomassie durante la noche a temperatura ambiente.
Lave el gel con agua bidestilada durante dos horas antes de la adquisición de la imagen. Para detectar la ubiquitilación, la modificación de SUMO-1 o SUMO-2 y 3, la ribosilación de ADP, los DPC TOP1, TOP2 alfa o TOP2 beta totales, diluya los anticuerpos correspondientes como se muestra en la tabla. A continuación, transfiera el gel en una dilución adecuada del anticuerpo primario en tampón de bloqueo e incube las membranas durante la noche a cuatro grados centígrados.
Una vez hecho esto, incubar la membrana lavada con PBST con un anticuerpo secundario diluido 5.000 veces en tampón de bloqueo durante 60 minutos a temperatura ambiente antes de desarrollar la membrana con un reactivo de quimioluminiscencia mejorado. Adquiera una imagen utilizando el sistema de imágenes. La exposición a la camptotecina indujo la formación de CPD TOP1.
La formación de DPCs TOP1 alcanzó su punto máximo después de 20 minutos de exposición a la camptotecina, similar a la modificación anti-SUMO-2 y 3. También se observó la culminación de la modificación y ubiquitilación de SUMO-1. Las CPD y sus modificaciones SUMO-2 y 3 TOP1 disminuyeron de forma dependiente de la dosis de camptotecina.
Los DPC TOP2 inducidos por adipocitos y la modificación de SUMO-2 y 3 alcanzaron su punto máximo a los 20 minutos y luego disminuyeron. En comparación, las modificaciones de SUMO-1 y ubiquitina alcanzaron su punto máximo a los 60 minutos. Los CPD inducidos por formaldehído y sus SUMO-2 y 3, SUMO-1 y ubiquitilación se formaron y acumularon de manera dependiente de la dosis.
La detección cuantitativa de la parilación de las DPC TOP1 utilizando un anticuerpo anti-PAR, la parilación de la DPC TOP1 no fue detectable a menos que se añadiera un inhibidor de PARG a la célula, lo que sugiere que la parilación se produce rápidamente y es muy dinámica.
