Bereiten Sie zunächst das Experiment und das Material vor, das für die Befestigung und Positionierung von Zebrafischen erforderlich ist. Beobachten Sie die gelähmte Zebrafischlarve unter einem Stereomikroskop, um sicherzustellen, dass ihre Bewegung aufgehört hat. Beurteilen Sie die Gesundheit der Larven visuell, indem Sie ihren Herzschlag überprüfen.
Geben Sie dann mit einer Transferpipette eine einzelne Zebrafischlarve in das 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit Agarosegel. Gießen Sie das Agarose-Gel in die Petrischale, um eine ein bis zwei Millimeter dicke Schicht zu erhalten. Übertragen Sie die Larve mit einer Transferpipette aus dem Mikrozentrifugenröhrchen in die Petrischale.
Achten Sie darauf, die Larve in die Mitte der Schale zu legen. Positionieren Sie die Larve mit einer Pinzette in der gewünschten Ausrichtung, so dass Kopf und Schwanz flach sind. Drehen Sie dann die Larve mit einer Pinzette, um beide Augen auszurichten.
Warten Sie nach Abschluss des Alignments, bis sich das Agarosegel verfestigt hat, bevor Sie die Petrischale mit Eiwasser füllen. Stellen Sie die Schale mit der eingebetteten Larve zur Bildaufnahme auf den Mikroskoptisch. Schalten Sie das Mikroskop ein und lokalisieren Sie die Larve in der Mitte des Sichtfeldes.
Stellen Sie mit der Bilderfassungssoftware die Bildgebungsparameter ein. Wenn das Bild gesättigt ist, reduzieren Sie die Laserleistung. Finden Sie als Nächstes das Gehirn der Larve, indem Sie den Tisch bewegen, und bestimmen Sie seine Dicke im Live-View-Modus in der Software, indem Sie die Fokusebenen manuell nach oben und unten ändern.
Legen Sie die untere und obere Grenze der Lautstärke fest. Fahren Sie dann mit der Bildaufnahme für das eingestellte Sichtfeld fort. Für die volumetrische Strukturbildgebung erfassen Sie ein 3D-Bild des gesamten Gehirns, indem Sie nacheinander 2D-Bilder jeder Z-Ebene erhalten.
Für die funktionelle Bildgebung einer einzelnen Z-Ebene werden Zeitreihenbilder der neuronalen Aktivität des Gehirns in einer bestimmten Tiefe aufgenommen.