Per iniziare, prepara l'esperimento e il materiale necessario per il montaggio e il posizionamento del pesce zebra. Sotto uno stereomicroscopio, osserva la larva di zebrafish paralizzata per verificare che il suo movimento si sia fermato. Valutare visivamente la salute delle larve controllando il battito cardiaco.
Quindi, utilizzando una pipetta di trasferimento, posizionare un singolo pesce zebra larvale nel tubo di microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente gel di agarosio. Versare il gel di agarosio nella piastra di Petri per fare uno strato da uno a due millimetri. Trasferire la larva dal tubo della microcentrifuga alla piastra di Petri usando una pipetta di trasferimento.
Assicurati di posizionare la larva al centro del piatto. Usando una pinza, posiziona la larva nell'orientamento desiderato in modo che la testa e la coda siano piatte. Quindi, usando una pinza, ruotare la larva per livellare entrambi gli occhi.
Al termine dell'allineamento, attendere che il gel di agarosio si sia solidificato prima di riempire la capsula di Petri con acqua all'uovo. Posizionare il piatto con la larva incorporata sul palco del microscopio per l'acquisizione delle immagini. Accendi il microscopio e individua la larva al centro del campo visivo.
Utilizzando il software di acquisizione delle immagini, impostare i parametri di imaging. Se l'immagine è satura, ridurre la potenza del laser. Quindi, trova il cervello della larva spostando il palcoscenico e determina il suo spessore utilizzando la modalità Live View nel software cambiando manualmente i piani focali su e giù.
Impostare i limiti inferiore e superiore del volume. Quindi procedere con l'acquisizione dell'immagine per il campo visivo impostato. Per l'imaging strutturale volumetrico, acquisire un'immagine 3D dell'intero cervello ottenendo immagini 2D di ciascun piano Z in sequenza.
Per l'imaging funzionale di un singolo piano Z, acquisire immagini di serie temporali dell'attività neuronale del cervello a una certa profondità.
