ابدأ بإعداد محاليل مخزون لجميع الأجسام المضادة بمعدل 2،000 ميكروغرام لكل ملليلتر. ثم لكل جسم مضاد، قم بتسمية أنابيب التخفيف بتركيزات كل منها، بما في ذلك اسم الجسم المضاد. قم أيضا بتضمين أنبوب فارغ لكل جسم مضاد كعنصر تحكم في مركبة PBS-TBN فقط.
بعد ذلك ، أضف 75 ميكرولترا من PBS-TBN إلى جميع أنابيب تخفيف الأجسام المضادة التي تحمل علامة 500 ميكروغرام لكل ملليلتر وأقل ، بما في ذلك أنابيب التحكم في السيارة فقط. لكل جسم مضاد ، ماصة 150 ميكرولتر من محلول المخزون في الأنبوب المسمى 1،000 ميكروغرام لكل ملليلتر. لإنشاء سلسلة تخفيف كاملة لكل جسم مضاد ، انقل 75 ميكرولترا من أنبوب 1،000 ميكروغرام لكل مليلتر إلى التخفيف المنخفض اللاحق في السلسلة.
بعد ذلك ، أغلق أنبوب التخفيف المكتمل حديثا وقم بدوامته لفترة وجيزة. ثم أضف 25 ميكرولترا من الأجسام المضادة المخففة إلى الآبار المخصصة للوحة عيار ميكروي 96 بئرا ، متبوعا بإضافة 25 ميكرولترا من PDL1 البشري المؤتلف بالبيوتينيل إلى كل بئر تفاعل. قم بتغطية لوحة المعايرة الدقيقة بختم لاصق أو بلاستيكي واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة مع الهز على شاكر اللوحة المدارية عند 600 دورة في الدقيقة.
بعد ذلك ، قم بتخفيف حبات PD1 البشرية المؤتلفة المقترنة بتركيز 50،000 حبة لكل مليلتر باستخدام PBS-TBN. قم بإزالة لوحة تفاعل العيار الدقيق المكونة من 96 بئرا من الخلاط وقشر ختم اللوحة اللاصقة. أضف 50 ميكرولترا من خليط حبة PD1 البشري المؤتلف إلى كل بئر.
أغلق اللوحة بإحكام واحتضانها لمدة ساعة واحدة في الظلام في درجة حرارة الغرفة على شاكر مداري مضبوط على 600 دورة في الدقيقة. بعد الحضانة ، قم بإزالة ختم اللوحة اللاصقة بعناية. ثم ضع اللوحة على فاصل اللوحة المغناطيسية لمدة دقيقتين لشل حركة الخرز.
تأكد من توصيل المغناطيس ولوحة المعايرة الدقيقة بإحكام. اقلب الطبق وتخلص من المادة الطافية بعناية. لغسل كواشف التفاعل الزائدة من الخرز ، قم بإزالة لوحة العيار الدقيق من فاصل اللوحة المغناطيسية وأضف 150 ميكرولترا من PBS-TBN إلى كل بئر.
بعد إزالة مانع التسرب وشل حركة الخرز كما هو موضح ، تأكد من تأمين المغناطيس ولوحة المعايرة الدقيقة وإلقاء المادة الطافية. أضف الآن 100 ميكرولتر من محلول عمل SAPE إلى كل بئر تفاعل وأعد تعليق الخرز عن طريق الماصة. أغلق اللوحة واحتضانها لمدة ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
ثم قم بإزالة مانع تسرب الألواح اللاصقة بعناية بمجرد تثبيت الخرز وكذلك تثبيت المغناطيس واللوحة معا. تفريغ طاف بلطف عن طريق قلب لوحة. لغسل SAPE الزائد من الخرز ، قم بإزالة لوحة العيار الدقيق من حامل اللوحة المغناطيسية وأضف 150 ميكرولترا من PBS-TBN إلى كل بئر لإعادة تعليق الخرز.
ثم شل حركة الخرز عن طريق وضع لوحة microtiter على فاصل لوحة مغناطيسية لمدة دقيقتين. بعد التأكد من تأمين لوحة المغناطيس والمعايرة الدقيقة ، اقلب اللوحة وأزل المادة الطافية. بعد ذلك ، أضف 100 ميكرولتر من الغلوبولين المناعي المخفف Brilliant Violet 421 المترافق المضاد للإنسان أو الأرانب G إلى آبارهم.
أغلق اللوحة واحتضانها لمدة ساعة في الظلام في درجة حرارة الغرفة. ثم شل حركة الخرز وإزالة تسرب لوحة لاصقة. تأكد من تأمين المغناطيس ولوحة المعايرة الدقيقة وتفريغ المادة الطافية.
اغسل الأجسام المضادة الثانوية الزائدة من الخرز بإضافة 150 ميكرولتر من PBS-TBN إلى كل بئر لإعادة تعليق الخرزات. بعد ذلك ، ضع لوحة المعايرة الدقيقة على فاصل اللوحة المغناطيسية لمدة دقيقتين لشل حركة الخرز. تأكد من أن المغناطيس ولوحة المعايرة الدقيقة معا بشكل آمن ثم اقلب اللوحة وتفريغ المادة الطافية.
بمجرد إزالة المخزن المؤقت الرابع والأخير للغسيل ، أخرج لوحة المعايرة الدقيقة من فاصل اللوحة المغناطيسية. باستخدام ماصة ، أعد تعليق الخرز في 100 ميكرولتر من PBS-TBN لكل بئر. أخيرا ، لتحديد متوسط شدة الفلورسنت لكل تفاعل ، اقرأ اللوحة الموجودة على نظام تحليل تدفق المراسل المزدوج مع ضبط حجم الشفط على 50 ميكرولتر ، والحد الأدنى لعدد الخرزات إلى 100 حبة ، وإعداد المهلة إلى 40 ثانية ، ونطاق البوابة إلى 7،000 إلى 17،000 ، ووضع التشغيل للمراسل المزدوج.
منعت جميع الأجسام المضادة الببتيد الأربعة متعددة النسيلة المضادة ل PDL1 تفاعل PDL1 البشري المؤتلف مع PD1. تراوحت النسبة المئوية لتثبيط الأجسام المضادة للببتيد المختلفة المضادة ل PDL1 من 48٪ إلى 74٪ عند الحد الأقصى للتركيز المختبر البالغ 1000 ميكروغرام لكل ملليلتر. حقق الجسم المضاد أحادي النسيلة ذو التحكم الإيجابي أتيزوليزوماب حصارا بنسبة 92٪ لتفاعل PD1-PDL1 بأقصى تركيز تم اختباره وهو أربعة ميكروغرام لكل ملليلتر.
أشار تحليل الربط المقارن للأجسام المضادة المرشحة التي يسببها PDL1 vax إلى PDL1 البشري المؤتلف إلى أن جميع الأجسام المضادة الببتيدية الأربعة متعددة النسيلة المضادة ل PDL1 مرتبطة ب PDL1 البشري المؤتلف بطريقة تعتمد على التركيز. أظهر الجسم المضاد ل PDL1 (130) أعلى إشارة ربط RH PDL1 من أربعة مرشحين للأجسام المضادة التي يسببها PDL1 vax.
