首先制备每毫升 2， 000 微克的所有抗体的储备溶液。然后，对于每种抗体，用各自的浓度标记稀释管，包括抗体的名称。还包括每种抗体的空白管，作为 PBS-TBN 载体的唯一对照。
接下来，将 75 微升 PBS-TBN 添加到所有标记为 500 微克/毫升及以下的抗体稀释管中，包括仅限载体的对照管。对于每种抗体，将 150 微升储备溶液移液到标记为每毫升 1， 000 微克的试管中。要为每种抗体创建完整的稀释系列，请将 75 微升从每毫升 1， 000 微克的试管转移到该系列中随后的较低稀释液中。
然后，关闭新完成的稀释管并短暂涡旋。然后将 25 微升稀释的抗体加入 96 孔微量滴定板的指定孔中，然后向每个反应孔中加入 25 微升生物素化重组人 PDL1。用箔或塑料粘合剂密封盖住微量滴定板，并在室温下以 600 RPM 在轨道板振荡器上振荡孵育一小时。
接下来，用 PBS-TBN 将重组人 PD1 偶联珠稀释至每毫升 50， 000 个珠子的浓度。从振荡器中取出 96 孔微量滴定反应板并剥离粘合板密封。向每个孔中加入 50 微升重组人 PD1 偶联微珠混合物。
将板密封并置于室温下，在设置为 600 RPM 的轨道振荡器上在黑暗中孵育 1 小时。孵育后，小心地取下胶板密封。然后将板放在磁性板分离器上两分钟以固定珠子。
确认磁铁和微量滴定板连接牢固。将板翻转过来，小心地丢弃上清液。要从珠子中洗涤多余的反应试剂，请从磁性板分离器中取出微量滴定板，并向每个孔中加入 150 微升 PBS-TBN。
如图所示取下密封剂并固定珠子后，确认磁铁和微量滴定板已固定并倾倒上清液。现在向每个反应孔中加入 100 微升 SAPE 工作溶液，并通过移液重悬珠子。密封板并在室温下在黑暗中孵育一小时。
然后，一旦珠子固定并将磁铁和板固定在一起，请小心地取下粘合板密封剂。通过倒置板轻轻倾倒上清液。要从珠子上洗掉多余的SAPE，请从磁性板支架上取下微量滴定板，并向每个孔中加入150微升PBS-TBN以重悬珠子。
然后通过将微量滴定板放在磁性板分离器上两分钟来固定珠子。确认磁铁和微量滴定板固定后，倒置板并除去上清液。接下来，向各自的孔中加入 100 微升稀释的 Brilliant Violet 421 偶联抗人或抗兔免疫球蛋白 G。
密封板并在室温下在黑暗中孵育一小时。然后固定珠子并取下粘合板密封剂。确认磁铁和微量滴定板已固定并倾倒上清液。
通过向每个孔中加入 150 微升 PBS-TBN 以重悬磁珠来洗涤珠子中多余的二抗。接下来，将微量滴定板放在磁性板分离器上两分钟以固定珠子。确认磁铁和微量滴定板牢固地结合在一起，然后倒置板并倾倒上清液。
取出第四次也是最后一次洗涤缓冲液后，从磁性板分离器中取出微量滴定板。使用移液管，将珠子重悬于每孔100微升PBS-TBN中。最后，为了确定每个反应的中值荧光强度，在双报告器流分析系统上读取板，吸液体积设置为 50 微升，最小微珠数量设置为 100 个微珠，超时设置为 40 秒，门控范围设置为 7， 000 至 17， 000，操作模式设置为双报告器。
所有四种多克隆抗PDL1肽抗体均阻断了重组人PDL1与PD1的相互作用。在最大测试浓度为每毫升 1， 000 微克时，不同抗 PDL1 肽抗体的抑制百分比范围为 48% 至 74%。阳性对照单克隆抗体阿替利珠单抗在最大测试浓度为每毫升 4 微克时实现了 92% 的 PD1-PDL1 相互作用阻断。
PDL1 vax 诱导的候选抗体与重组人 PDL1 的比较结合分析表明，所有四种多克隆抗 PDL1 肽抗体都以浓度依赖性方式与重组人 PDL1 结合。抗PDL1（130）抗体在4种PDL1 vax诱导的候选抗体中显示出最高的RH PDL1结合信号。
