Start med at forberede stamopløsninger af alle antistoffer ved 2.000 mikrogram pr. Milliliter. Derefter mærkes fortyndingsrørene for hvert antistof med deres respektive koncentrationer, herunder antistoffets navn. Inkluder også et blankt rør for hvert antistof som PBS-TBN-køretøjskontrol.
Derefter tilsættes 75 mikroliter PBS-TBN til alle antistoffortyndingsrør mærket som 500 mikrogram pr. milliliter og derunder, inklusive køretøjets eneste kontrolrør. For hvert antistof pipetter 150 mikroliter stamopløsning ind i røret mærket som 1.000 mikrogram pr. Milliliter. For at skabe en komplet fortyndingsserie for hvert antistof overføres 75 mikroliter fra 1.000 mikrogram pr. Milliliter rør til den efterfølgende lavere fortynding i serien.
Luk derefter det nyligt afsluttede fortyndingsrør og hvirvl det kort. Derefter tilsættes 25 mikroliter fortyndede antistoffer i de udpegede brønde i en 96-brønds mikrotiterplade, efterfulgt af tilsætning af 25 mikroliter biotinyleret rekombinant human PDL1 til hver reaktionsbrønd. Mikrotiterpladen dækkes med en klæbeforsegling af folie eller plast og inkuberes ved stuetemperatur i en time med omrystning på en orbitalpladeryster ved 600 omdr./min.
Fortynd derefter de rekombinante humane PD1-koblede perler til en koncentration på 50.000 perler pr. Milliliter med PBS-TBN. Fjern mikrotiterreaktionspladen med 96 brønde fra rysteren, og skræl klæbepladeforseglingen. Tilsæt 50 mikroliter af den rekombinante humane PD1-koblede perleblanding til hver brønd.
Pladen forsegles tæt og inkuberes i en time i mørke ved stuetemperatur på en orbitalryster indstillet til 600 omdr./min. Efter inkubation fjernes forsigtigt klæbepladeforseglingen. Placer derefter pladen på magnetpladeseparatoren i to minutter for at immobilisere perlerne.
Bekræft, at magneten og mikrotiterpladen er korrekt tilsluttet. Vend tallerkenen om og kassér supernatanten forsigtigt. For at vaske de overskydende reaktionsreagenser fra perlerne skal du fjerne mikrotiterpladen fra magnetpladeseparatoren og tilsætte 150 mikroliter PBS-TBN til hver brønd.
Efter fjernelse af forsegleren og immobilisering af perlerne som vist, bekræftes det, at magneten og mikrotiterpladen er fastgjort, og supernatanten dumpes. Tilsæt nu 100 mikroliter SAPE-arbejdsløsning til hver reaktionsbrønd og resuspender perlerne ved pipettering. Forsegl pladen og inkuber den i en time ved stuetemperatur i mørket.
Fjern derefter forsigtigt klæbepladeforsegleren, når perlerne er immobiliseret, samt magneten og pladen er fastgjort sammen. Supernatanten dumpes forsigtigt på hovedet på hovedet. For at vaske overskydende SAPE af perlerne skal du fjerne mikrotiterpladen fra magnetpladeholderen og tilføje 150 mikroliter PBS-TBN til hvert hul for at resuspendere perlerne.
Derefter immobiliseres perlerne ved at placere mikrotiterpladen på en magnetisk pladeseparator i to minutter. Når det er bekræftet, at magneten og mikrotiterpladen er fastgjort, vendes pladen, og supernatanten fjernes. Derefter tilsættes 100 mikroliter fortyndet Brilliant Violet 421 konjugeret anti-human eller anti-kanin immunoglobulin G til deres respektive brønde.
Forsegl pladen og inkuber den i en time i mørke ved stuetemperatur. Derefter immobiliserer perlerne og fjerner klæbepladeforsegleren. Det kontrolleres, at magneten og mikrotiterpladen er fastgjort, og supernatanten dumpes.
Vask de overskydende sekundære antistoffer fra perlerne ved at tilsætte 150 mikroliter PBS-TBN til hver brønd for at resuspendere perlerne. Placer derefter mikrotiterpladen på magnetpladeseparatoren i to minutter for at immobilisere perlerne. Det kontrolleres, at magneten og mikrotiterpladen er sikkert sammen, og vend derefter pladen på hovedet, og supernatanten dumpes.
Når den fjerde og sidste vaskebuffer er fjernet, tages mikrotiterpladen ud af magnetpladeseparatoren. Brug en pipette til at resuspendere perlerne i 100 mikroliter PBS-TBN pr. Brønd. Endelig, for at bestemme medianfluorescerende intensitet af hver reaktion, skal du læse pladen på det dobbelte reporterflowanalysesystem med aspirationsvolumenet indstillet til 50 mikroliter, minimum perleantal til 100 perler, timeout-indstillingen til 40 sekunder, gating-området til 7.000 til 17.000 og driftstilstand til dobbeltreporteren.
Alle fire polyklonale anti-PDL1-peptidantistoffer blokerede den rekombinante humane PDL1-interaktion med PD1. Procentdelen af inhibering af de forskellige anti-PDL1-peptidantistoffer varierede fra 48% til 74%ved den maksimale testede koncentration på 1.000 mikrogram pr. Milliliter. Det positive kontrol monoklonale antistof atezolizumab opnåede 92% blokade af PD1-PDL1-interaktionen ved den maksimale testede koncentration på fire mikrogram pr. milliliter.
Sammenlignende bindingsanalyse af PDL1 vax-inducerede kandidatantistoffer mod rekombinant human PDL1 indikerede, at alle fire polyklonale anti-PDL1 peptidantistoffer bundet til rekombinant human PDL1 på en koncentrationsafhængig måde. Anti-PDL1(130)antistoffet viste det højeste RH PDL1-bindingssignal af de fire PDL1 vax-inducerede antistofkandidater.
