Begin met het bereiden van voorraadoplossingen van alle antilichamen met 2.000 microgram per milliliter. Label vervolgens voor elk antilichaam de verdunningsbuisjes met hun respectieve concentraties, inclusief de naam van het antilichaam. Voeg ook een blanco buis toe voor elk antilichaam als PBS-TBN-voertuigcontrole.
Voeg vervolgens 75 microliter PBS-TBN toe aan alle antilichaamverdunningsbuisjes met het label 500 microgram per milliliter en lager, inclusief de regelbuisjes voor alleen het voertuig. Pipetteer voor elk antilichaam 150 microliter van de stockoplossing in de buis met het label 1.000 microgram per milliliter. Om een volledige verdunningsreeks voor elk antilichaam te creëren, brengt u 75 microliter over van de buis van 1.000 microgram per milliliter naar de daaropvolgende lagere verdunning in de reeks.
Sluit daarna de pas voltooide verdunningsbuis en draai deze kort in een draaikolk. Voeg vervolgens 25 microliter verdunde antilichamen toe aan de daarvoor bestemde putjes van een microtiterplaat met 96 putjes, gevolgd door het toevoegen van 25 microliter gebiotinyleerde recombinante menselijke PDL1 aan elk reactieputje. Bedek de microtiterplaat met een folie of plastic zelfklevende afdichting en incubeer gedurende een uur bij kamertemperatuur met schudden op een orbitale plaatschudder bij 600 RPM.
Verdun vervolgens de recombinante humane PD1-gekoppelde kralen tot een concentratie van 50.000 kralen per milliliter met PBS-TBN. Verwijder de 96-wells microtiter-reactieplaat van de shaker en verwijder de zelfklevende plaatafdichting. Voeg 50 microliter van het recombinante humane PD1-gekoppelde kralenmengsel toe aan elk putje.
Sluit de plaat goed af en incubeer gedurende een uur in het donker bij kamertemperatuur op een orbitale shaker die is ingesteld op 600 RPM. Verwijder na het incuberen voorzichtig de zelfklevende plaatafdichting. Plaats vervolgens de plaat gedurende twee minuten op de magnetische platenscheider om de kralen te immobiliseren.
Controleer of de magneet en de microtiterplaat goed zijn aangesloten. Draai het bord om en gooi het supernatans voorzichtig weg. Om de overtollige reactiereagentia van de korrels te wassen, verwijdert u de microtiterplaat van de magnetische plaatscheider en voegt u 150 microliter PBS-TBN toe aan elk putje.
Nadat u de sealer hebt verwijderd en de kralen hebt geïmmobiliseerd zoals gedemonstreerd, bevestigt u of de magneet en de microtiterplaat zijn vastgezet en dumpt u het supernatant. Voeg nu 100 microliter SAPE-werkoplossing toe aan elke reactieput en resuspendeer de korrels door middel van pipetteren. Sluit de plaat af en incubeer deze een uur bij kamertemperatuur in het donker.
Verwijder vervolgens voorzichtig de zelfklevende plaatsealer zodra de kralen zijn geïmmobiliseerd en de magneet en plaat aan elkaar zijn bevestigd. Giet het supernatans voorzichtig weg door de plaat om te keren. Om de overtollige SAPE van de kralen te wassen, verwijdert u de microtiterplaat uit de magnetische plaathouder en voegt u 150 microliter PBS-TBN toe aan elk putje om de kralen opnieuw te suspenderen.
Immobiliseer vervolgens de kralen door de microtiterplaat gedurende twee minuten op een magnetische platenscheider te plaatsen. Nadat u hebt bevestigd dat de magneet en de microtiterplaat zijn vastgezet, keert u de plaat om en verwijdert u het supernatant. Voeg vervolgens 100 microliter verdund Brilliant Violet 421 geconjugeerd anti-humaan of anti-konijn immunoglobuline G toe aan hun respectievelijke putjes.
Sluit de plaat af en incubeer deze een uur in het donker bij kamertemperatuur. Immobiliseer vervolgens de kralen en verwijder de zelfklevende plaatsealer. Controleer of de magneet en de microtiterplaat goed vastzitten en dump het supernatant.
Was de overtollige secundaire antilichamen van de korrels door 150 microliter PBS-TBN aan elk putje toe te voegen om de korrels te resuspenderen. Plaats vervolgens de microtiterplaat gedurende twee minuten op de magnetische platenscheider om de kralen te immobiliseren. Controleer of de magneet en de microtiterplaat stevig bij elkaar zitten en keer de plaat om en dump het supernatant.
Zodra de vierde en laatste wasbuffer is verwijderd, haalt u de microtiterplaat uit de magnetische platenscheider. Resuspendeer de korrels met een pipet in 100 microliter PBS-TBN per putje. Ten slotte, om de mediane fluorescerende intensiteit van elke reactie te bepalen, leest u de plaat op het dubbele reporterstroomanalysesysteem met het aspiratievolume ingesteld op 50 microliter, het minimale aantal kralen op 100 kralen, de time-outinstelling op 40 seconden, het poortbereik op 7, 000 tot 17.000 en de bedrijfsmodus op de dubbele reporter.
Alle vier de polyklonale anti-PDL1-peptide-antilichamen blokkeerden de recombinante menselijke PDL1-interactie met PD1. Het percentage remming van de verschillende anti-PDL1-peptide-antilichamen varieerde van 48% tot 74% bij de maximaal geteste concentratie van 1.000 microgram per milliliter. Het positieve controle monoklonaal antilichaam atezolizumab bereikte 92% blokkade van de PD1-PDL1 interactie bij de maximaal geteste concentratie van vier microgram per milliliter.
Vergelijkende bindingsanalyse van PDL1 vax-geïnduceerde kandidaat-antilichamen tegen recombinant humaan PDL1 gaf aan dat alle vier polyklonale anti-PDL1-peptide-antilichamen op een concentratie-afhankelijke manier gebonden zijn aan recombinant humaan PDL1. Het anti-PDL1(130)-antilichaam vertoonde het hoogste RH PDL1-bindingssignaal van de vier PDL1-vax-geïnduceerde antilichaamkandidaten.
